Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Summary

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Abstract

Das Kennzeichen der humoralen Immunität ist funktional ASCs zu erzeugen, das zu synthetisieren und ABS spezifisch für ein Antigen (Ag), beispielsweise einem Pathogen sekretieren, und sind für Wirtsabwehr eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung des funktionellen Status der humoralen Immunantwort eines Individuums, sowohl Serum Abs und Zirkulieren ASCs als funktionelle Auslesungen üblicherweise gemessen. Beim Menschen ist peripherem Blut die bequemste und leicht zugänglich Probe, die zur Bestimmung der humoralen Immunantwort durch den Host B-Zellen hervorgerufen werden können. Distinct B-Zell-Untergruppen, einschließlich ASCS, kann über die Auswahl mit linienspezifischen Ab-konjugierte Mikrobeads oder über Zellsortierung mit Durchflusszytometrie direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden. Darüber hinaus kann gereinigtes naiven und Gedächtnis-B-Zellen in Kultur in ASCs aktiviert und differenziert werden. Die funktionellen Aktivitäten von ASCs zu Ab Sekretion beitragen kann durch ELISpot quantifiziert werden, was ein Assay, Enzym konvergiert ist-linked immunoabsorbance-Assay (ELISA) und Western-Blot-Technologien, um die Aufzählung einzelner ASCS auf Einzelzellebene zu ermöglichen. In der Praxis hat sich die ELISPOT-Tests zunehmend verwendet Impfstoffwirksamkeit zu bewerten, wegen der Leichtigkeit der Handhabung einer großen Anzahl von Blutproben. Die Verfahren zur Isolierung von humanen B – Zellen aus dem peripheren Blut, die Differenzierung von B – Zellen in ASCs in vitro und die Verwendung von ELISpot für die Quantifizierung von Gesamt – IgM- und IgG-ASCs wird hier beschrieben.

Introduction

B-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der humoralen Immunität. Sie entwickeln sich zunächst im Knochenmark und geben Sie den Blutstrom als naive B-Zellen, die in die lymphatischen Geweben, wie der Milz wandern können, Lymphknoten und Mandeln, für die weitere Entwicklung. Bei Ag Begegnung einige naive B-Zellen wandern in Lymphfollikeln, wo Keimzentrum-B-Zellen in den Speicher B-Zellen und Plasmablasten unterscheiden können (PBS) / Plasmazellen (PCs). Während die meisten PBs / PCs in den Blutstrom Egress, liegen einige schließlich im Knochenmark terminale Differenzierung in langlebigen PCs ¹ zu unterziehen. B – Zellen im Umlauf sind heterogen, und in einem stabilen Zustand, PBs / PCs sind selten im peripheren Blut ^2. Als Folge der Verfügbarkeit von Lineage-spezifische Oberflächenmarker hat Durchflusszytometrie eine beliebte Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der B-Zell-Untergruppen in peripherem Blut werden. Eine erweiterte Anwendung von Fluss cytometry ist die Zugabe eines Zellsortierer-Funktion, die die Trennung und Isolation der einzelnen Untergruppen von B-Zellen mit hoher Reinheit ermöglicht. Basierend auf der Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Entwicklungsstadien werden menschliche zirkulierende B – Zellen allgemein in drei Haupt Subpopulationen: naive B – Zellen (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), Gedächtnis – B – Zellen (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-) und PBs / PCs (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Abbildung 1). Naive B-Zellen von Natur haben Ags nicht auf. Jedoch können sie differenziert IgM ⁺ CD27 ⁺ Gedächtnis – B – Zellen sein. Obwohl naive B – Zellen sind homogene B-Zell – Antigenrezeptor (BCR) -assoziierten Moleküle (zB CD19, CD20 und CD22) sie heterogen in ihrer Immunoglobulin Repertoire in ⁵ ausdrückt. Die Mehrheit der CD27 ⁺ Gedächtnis – B – Zellen können in CD27 unterschieden werden+ / hallo CD38 ⁺ PBs / PCs ^6. Darüber hinaus Gedächtnis – B – Zellen und PBs / PCs sind polyklonalen und zeigen Entwicklungs und funktionelle Heterogenität ^4-7. PBs / PCs im Umlauf sind in der Regel von kurzer Dauer und nicht CD138 Ausdruck bringen, sondern solche aus im Knochenmark zu beruhigen wird terminal differenzieren und werden langlebig. Ausdifferenzierten PCs exprimieren CD138 und CD27 – Moleküle auf ihren Oberflächen ⁸ herunterregulieren. Da sowohl PBs und PCs geeignet sind, sezer Abs, in vielen Fällen sind sie gemeinsam als ASCS bezeichnet. Im Gegensatz dazu weder naive B – Zellen noch Gedächtnis – B – Zellen können erhebliche Mengen an Abs ^9-10 produzieren. Dennoch, als isoliert, sowohl naiven und Gedächtnis – B – Zellen können in 3 in ASCS differenziert – 10 Tage , an denen ⁶ in der richtigen Kulturbedingungen ^{gelegt, 15.11.} In der Tat, abgeleitet ASCS von in vitro Differenzierung teilen ähnliche Oberfläche Ausdrücke von CD27 und CD38 mit denen direkt isoliert from peripheren Blut ^6. Darüber hinaus unterscheiden sich die ASCs in vitro eine geringe Oberflächen CD20, ähnlich dem von zirkulierendem PBs / PCs ⁶ auszudrücken. Obwohl die Kultur stamm ASCs alle kurzlebigen sind, können sie Abs sezernieren, was anzeigt, dass sie funktionell kompetent sind und in der Lage der humoralen Immunität beitragen.

Beide ELISA und ELISpot sind bei weitem die am häufigsten angewandten Methoden, mit denen auf die humorale Immunantwort funktionelle Informationen zu erhalten. ELISA ist ein 96-Well – Platte-basierten Assays, und es ist häufig der Titer des Serums Ag-spezifischen Abs und anderen Analyten (zB Cytokine) zu messen. Es ist bequem und skalierbar. ELISA ist ein Festphasen Enzym – Assay zu verwenden , ¹⁶ das Vorhandensein von Abs oder anderen Substanzen, wie Serum, in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Die Auslesungen aus Serum ELISAs wurden, um die Immunantwort des Körpers darzustellen weit verbreitet. Ein Werkzeug erforderlich für den Erwerb von Readouts von ELISA-Assays ist ein spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesegerät. Der Leser kann die optische Dichte (OD) der Endprodukte typischerweise bestimmen , aus der Reaktion von Meerrettich – Peroxidase (HRP) -konjugierte Detektions Abs und ihre spezifischen Substrate resultierenden ^17. Hinsichtlich der humoralen Immunantwort auf die Berichterstattung, Serum Ab Ebenen durch ELISA bestimmt bezeichnen die kollektive, nicht aber einzelne, Leistung von ASCS im Körper. Außerdem versagt ELISA berücksichtigt die Beteiligung von Gedächtnis-B-Zellen, die sekretieren Abs nicht.

Wie ELISA ist ELISpot ein weit verbreitetes Verfahren zum Nachweis und der Überwachung der Immunantwort in peripheren Blutproben ^17-18. ELISpot ist eine Technik, um einen Sandwich-ELISA bezogen. Darin werden die Zellen in das Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran-backed Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten gegeben für eine Kurzzeitkultur. Der ELISPOT-Assay ist analog zur Durchführung Western-Blotting auf einer Mikrotiterplatte und developing die Flecken auf der PVDF-Membran in jeder Vertiefung. Ein automatisiertes ELISpot Lesesystem oder ein Stereomikroskop für die manuelle Zählung ist nicht erforderlich. Der Hauptvorteil der ELISpot in einer Immunantwort Erfassungs ist seine hervorragende Empfindlichkeit in der Quantifizierung von ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen. Er berichtet ihre funktionellen Aktivitäten in humoralen und zellulären Immunität sind. Bei der Messung der humoralen Immunfunktion, Serum Ab durch ELISA und der Anzahl von ASCs bestimmt Ebenen durch ELISpot aufgezählt werden oft korreliert, aber die Daten Ablesungen aus diesen beiden Assays haben einige Unterschiede in der funktionellen Auswirkungen ^19-20. Der Hauptvorteil der ELISpot ist die Empfindlichkeit der Methode. Die Höhe des Serum-Ab-Titer, wie durch ELISA berichtet wird, semi-quantitativ als OD Ablesungen dargestellt, um die relative Ab Ebene bezeichnet, oder mehr quantitativ, als Konzentration Ablesungen, wenn eine bekannte Menge an den richtigen Isoformen der ABS ist als Referenz enthalten. Im Gegensatz dazu sind die Ergebnisse der ELISpot presented als die absolute Zahl der Anbeterinnen in einem Zellpool von Interesse (zB unfraktioniertem einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) und gereinigte B – Zellen aus PBMCs). ELISpot können einen einzelnen ASC erkennen, aber ELISA erfordert Ab Mengen von ASCS optimierten Assay abhängigen Konzentrationen vor der Messung zu erreichen. Daher ELISpot ist offensichtlich überlegen ELISA in Empfindlichkeit der Quantifizierung. Außerdem ist ELISpot auch für die in vitro differenzierte ASCs von aktivierten Gedächtnis – B – Zellen zu quantifizieren. Gedächtnis-B-Zellen sezernieren Abs nicht aber in ASCS bei Aktivierung unterscheiden kann; Sie haben daher keinen Beitrag zum Serum durch ELISA nachgewiesen Abs. Somit ist ELISpot die Methode der Wahl bei der Messung der Immunantwort des Speichers B-Zellen nach der Aktivierung in Kultur zirkuliert. Es ermöglicht die Überwachung der Aufrechterhaltung der Langzeit humorale Immunität.

Protocol

Menschliche periphere Blut muss von gesunden Spendern unter informierte Einwilligung eingeholt werden, und die Verwendung von Blutproben müssen den genehmigten Leitlinien, die einzelnen Institutional Review Boards entsprechen. In dieser Studie auf das Protokoll menschlichem Blut an einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISPOT – Tests verwenden (Abbildung 3) wurde durch den Internal Review Board der National Taiwan University Hospital (Protokollnummer 201307019RINB) …

Representative Results

PBMCs wurden von roten Blutkörperchen und anhaftenden Zellen verarmt (Schritte 1,2 bis 1,7). Ein Aliquot (2 x 10 6) Zellen wurden zu einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen , um die Populationen von naiven B – Zellen, Gedächtnis – B – Zellen und PBS / PCs in dem peripheren Blut (Abbildung 1) veranschaulichen. In diesem PBMCs des Spenders, etwa 10% der Lymphozyten waren CD19 + B – Zellen. In der B-Zellenraum ist der Anteil der CD19 +…

Discussion

Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

Normalerweise können RBCs effizient durch Lysepuffer (Schritt 1.2) gebrochen und gelöscht werden. Es ist wichtig, nicht die PBMCs mit dem RBC-Lyse-Puffer länger als 5 min inkubieren, da die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch das Ammoniumchlorid beeinflußt werden. Alternativ kann RBCs und Blutplättchen gleichzeitig durch das folgende Protokoll entfernt werden.

Mischen frisches Vollblut mit Säure-…

Materials

BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.