عزل، التمايز، والكمي للالإنسان الأجسام المضادة إفراز خلايا B من الدم: ELISPOT باعتبارها قراءات الوظيفية للالخلطية الحصانة
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
السمة المميزة للمناعة الخلطية هي لتوليد مخولا لصيانة طائرات وظيفية، التي تجميع وتفرز عبس محددة لمولدات المضادات (حج)، مثل مسببات المرض، وتستخدم للدفاع المضيف. لتحديد الكمي للوضع وظيفي للاستجابة المناعية الخلطية للفرد، يتم قياس كل من القيمة المطلقة المصل ومخولا لصيانة طائرات تعميم عادة باسم قراءات الوظيفية. في البشر، الدم المحيطي هو عينة الأكثر ملاءمة ويمكن الوصول إليها بسهولة والتي يمكن استخدامها لتحديد الاستجابة المناعية الخلطية التي تسببها الخلايا المضيفة (ب). متميزة فرعية B-الخلية، بما في ذلك مخولا لصيانة طائرات، ويمكن أن تكون معزولة مباشرة من الدم المحيطي عبر التحديد مع ميكروبيدات-نسب محددة أب مترافق أو عن طريق الفرز الخلية مع التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، النقاء الخلايا البائية ساذجة والذاكرة يمكن تفعيلها ومتباينة في مخولا لصيانة طائرات في الثقافة. الأنشطة الوظيفية للمخولا لصيانة طائرات للمساهمة في إفراز أب يمكن قياسها كميا بواسطة ELISPOT، وهو فحص أن يتقاطع انزيم-linked فحص immunoabsorbance (ELISA) والتكنولوجيات النشاف الغربية لتمكين تعداد مخولا لصيانة طائرات الفردية على مستوى خلية واحدة. في الممارسة العملية، تم استخدام فحص ELISPOT على نحو متزايد لتقييم نجاعة اللقاح بسبب سهولة التعامل مع عدد كبير من عينات الدم. طرق عزل الخلايا البائية الإنسان من الدم المحيطي، وسيتم وصف تمايز الخلايا البائية إلى مخولا لصيانة طائرات في المختبر، وتوظيف ELISPOT لتقدير حجم إجمالي IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات هنا.
Introduction
الخلايا باء تلعب دورا محوريا في تطوير مناعة الخلطية. أن تتطور في البداية في نخاع العظم وتدخل مجرى الدم وخلايا ساذجة B، والتي يمكن أن تهاجر إلى الأنسجة اللمفاوية، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، واللوزتين، لمزيد من التطوير. على لقاء حج، بعض الخلايا البائية ساذجة تهاجر إلى بصيلات اللمفاوية، حيث مركز جرثومي الخلايا باء يمكن أن تفرق في خلايا الذاكرة بي وplasmablasts (PBS) / خلايا البلازما (أجهزة الكمبيوتر). في حين أن معظم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر الخروج في مجرى الدم، وعدد قليل يقيمون في نهاية المطاف في نخاع العظام الخضوع التمايز النهائي إلى أجهزة الكمبيوتر طويلة الأمد 1. الخلايا البائية في التداول غير متجانسة، وفي حالة مستقرة، في برنامج تلفزيوني / أجهزة الكمبيوتر نادرة في الدم المحيطي 2. ونتيجة لتوافر علامات سطح-نسب محددة، أصبح التدفق الخلوي وسيلة شعبية لتحديد وتوصيف فرعية B-الخلية في الدم المحيطي. تطبيق موسعة من cytometr تدفقذ هو إضافة وظيفة الخلية فارز، الذي يسمح بفصل وعزل مجموعات فرعية فردية الخلايا البائية مع نقاء عالية. واستنادا إلى التعبير عن مستقبلات سطح محددة في مراحل نمو مختلفة، تصنف تعميم الخلايا البائية الإنسان عموما إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية رئيسية هي: الخلايا البائية ساذجة (CD19 + CD27 – CD38 -)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 + CD38 -)، و ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (الشكل 1). والخلايا البائية ساذجة بطبيعتها لم تواجه قسم الخدمات الزراعية. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تكون متباينة في الغلوبولين المناعي + CD27 + خلايا الذاكرة بي. على الرغم من أن الخلايا البائية ساذجة متجانسة في التعبير عن مستقبلات المستضد B-الخلية (BCR) جزيئات -associated (على سبيل المثال، CD19، CD20 CD22 و) وهم غير متجانسة في الغلوبولين المناعي ذخيرتهم 5. غالبية CD27 + خلايا الذاكرة بي يمكن أن تكون متباينة في CD27+ / مرحبا CD38 + ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا الذاكرة بي وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر هي بولكلونل ويحمل التنموي وظيفية التجانس 4-7. ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر في التداول قصيرة الأجل عادة ولا تعبر عن CD138، ولكن تلك التي ليستقر في نخاع العظام سوف يفرق عضال وتصبح طويلة الأمد. الميؤوس أجهزة الكمبيوتر متباينة تعبر عن CD138 وأسفل تنظيم جزيئات CD27 على سطحها 8. لأن كلا من برنامج تلفزيوني وأجهزة الكمبيوتر قادرة على إفراز عبس، في مناسبات عديدة يتم الرمز أنها مجتمعة باسم مخولا لصيانة طائرات. في المقابل، يمكن أن لا الخلايا البائية ساذجة ولا خلايا الذاكرة بي تنتج كميات لا يستهان بها عبس 9-10. ومع ذلك، عندما عزل، سواء ساذجة والذاكرة خلايا B ويمكن التفريق في مخولا لصيانة طائرات في 3-10 أيام عندما وضعت في ظروف التربية الصحيحة 6، 11-15. في الواقع، مخولا لصيانة طائرات المستمدة من في المختبر حصة التمايز تعبيرات سطح مماثلة من CD27 و CD38 مع تلك الاب معزولة مباشرةالدم المحيطي OM 6. بالإضافة إلى ذلك، مخولا لصيانة طائرات متباينة في المختبر تعبر عن تدني مستوى CD20 سطح، على غرار أن تعميم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. على الرغم من أن مخولا لصيانة طائرات المستمدة من الثقافة كلها لم تدم طويلا، فإنها يمكن أن تفرز عبس، مما يشير إلى أنها المختصة وظيفيا وقادرة على المساهمة في مناعة الخلطية.
كل من إليسا وELISPOT هي الآن الأساليب التطبيقية شيوعا التي للحصول على معلومات وظيفية على الاستجابة المناعية الخلطية. إليسا هو 96-كذلك فحص القائم على لوحة، وكثيرا ما يستخدم لقياس التتر من المصل عبس حج محددة والتحاليل الأخرى (على سبيل المثال، السيتوكينات). أنها مريحة وقابلة لل. تم تصميم ELISA لاستخدام الصلبة مرحلة انزيم فحص للكشف عن وجود عبس أو غيرها من المواد، مثل مصل، في عينة السائل 16. وقد استخدمت قراءات من ELISAs المصل على نطاق واسع لتمثيل الاستجابة المناعية للجسم. أداة ضرورية لاكتساب إعادةadouts من ELISA المقايسات هو قارئ صفيحة الطيفي. يمكن للقارئ أن تحديد الكثافة الضوئية (OD) من المنتجات النهائية عادة ينتج من تفاعل البيروكسيداز الفجل (HRP) -conjugated عبس كشف وركائز الخاصة بها (17). وفيما يتعلق الإبلاغ عن الاستجابة المناعية الخلطية، ومستويات أب المصل يحددها ELISA للدلالة على الجماعي، ولكن ليس الفردي، أداء مخولا لصيانة طائرات في الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، ELISA لا يأخذ في الاعتبار مشاركة خلايا B الذاكرة، التي لا تفرز عبس.
مثل إليسا، ELISPOT هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع للكشف ورصد الاستجابة المناعية في عينات الدم الطرفية 17-18. ELISPOT هي تقنية تتعلق شطيرة ELISA. في ذلك، وتوضع الخلايا في difluoride البولي فينيل (PVDF) آبار المدعومة من غشاء من 96 جيدا microplates للثقافة على المدى القصير. مقايسة ELISPOT مشابه لأداء الغربية النشاف على صفيحة والناميهز البقع على غشاء PVDF في كل بئر. مطلوب نظام قارئ ELISPOT الآلي أو مجهر تشريحي لالعد والفرز اليدوي. والميزة الرئيسية لELISPOT في الكشف عن رد فعل مناعي هي حساسية فائقة في تقدير حجم مخولا لصيانة طائرات والخلايا المفرزة للخلوى. فإنه تقارير الأنشطة الوظيفية في المناعة الخلطية والخلوية، على التوالي. في قياس وظيفة المناعة الخلطية، ومستويات أب المصل الذي يحدده إليسا وعدد من مخولا لصيانة طائرات تعداد بواسطة ELISPOT وغالبا ما ترتبط، ولكن قراءات البيانات من هذه المقايسات لهما بعض الاختلافات في الآثار الوظيفية 19-20. والميزة الرئيسية لELISPOT هي حساسيته من طريقة. وقدم مستوى التتر أب المصل كما ذكرت من قبل ELISA شبه كميا كما قراءات OD، تدل على مستوى أب النسبي، أو أكثر من الناحية الكمية، وقراءات تركيز عندما يتم تضمين كمية معروفة من isotypes المناسبة من القيمة المطلقة للرجوع إليها. في المقابل، فإن نتائج ELISPOT هي PRESENTEد كما أن العدد المطلق للمخولا لصيانة طائرات في بركة من الخلايا في المصالح (على سبيل المثال، غير المجزأ الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) والخلايا البائية النقاء من PBMCs). ELISPOT يمكن الكشف عن ASC واحدة، ولكن إليسا يتطلب كميات أب من مخولا لصيانة طائرات للوصول إلى تركيزات تعتمد على الفحص الأمثل قبل القياس. وبالتالي، ELISPOT متفوقة الواضح أن إليسا في حساسية الكمي. وعلاوة على ذلك، ELISPOT هو أيضا مناسبة لقياس في المختبر مخولا لصيانة طائرات متباينة من خلايا الذاكرة B تفعيلها. خلايا الذاكرة بي لا تفرز عبس ولكن يمكن أن تفرق في مخولا لصيانة طائرات على تفعيل. وبالتالي ليس لديهم المساهمة في القيمة المطلقة المصل الكشف عنها بواسطة ELISA. وهكذا، ELISPOT هو الأسلوب المفضل في قياس الاستجابة المناعية للتعميم خلايا الذاكرة بي بعد التنشيط في الثقافة. انها تسمح لرصد من الحفاظ على مناعة الخلطية على المدى الطويل.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل وتنقية الخلايا الطرفية الإنسان الدم B
عادة، كرات الدم الحمراء يمكن أن تمزق بكفاءة وبرأت التي تحلل العازلة (الخطوة 1.2). ومن المهم عدم احتضان PBMCs مع العازلة تحلل RBC أطول من 5 دقائق، وبقاء الخلية قد تتأثر كلوريد الأمونيوم. بدلا من ذلك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
