Humoral प्रतिरक्षण के एक कार्यात्मक readout के रूप में ELISPOT: अलगाव, भेदभाव, और मानव की मात्रा रक्त से एंटीबॉडी स्रावित बी प्रकोष्ठों
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
त्रिदोषन प्रतिरोधक क्षमता की बानगी कार्यात्मक ASCs, जो synthesize और इस तरह के एक रोगज़नक़ के रूप में एबीएस एक प्रतिजन (एजी), के लिए विशिष्ट छिपाना, और मेजबान रक्षा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं उत्पन्न करने के लिए है। एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यात्मक स्थिति के मात्रात्मक निर्धारण, दोनों के लिए सीरम पेट और घूम ASCs सामान्यतः कार्यात्मक readouts के रूप में मापा जाता है। मनुष्यों में, परिधीय रक्त सबसे सुविधाजनक और सहज सुलभ नमूना है कि मेजबान बी कोशिकाओं द्वारा हासिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ASCs सहित अलग-बी सेल सबसेट, वंश विशेष Ab संयुग्मित microbeads के साथ या सेल के माध्यम से प्रवाह cytometry के साथ छँटाई चयन के माध्यम से परिधीय रक्त से सीधे अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, शुद्ध भोले और स्मृति बी कोशिकाओं को सक्रिय और संस्कृति में ASCs में भेदभाव किया जा सकता है। ASCs Ab स्राव के लिए योगदान करने के कार्यात्मक गतिविधियों ELISPOT द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो एक परख है कि एंजाइम converges हैसे जुड़े immunoabsorbance परख (एलिसा) और पश्चिमी सोख्ता प्रौद्योगिकियों एकल कोशिका के स्तर पर अलग-अलग ASCs की गणना कर सकें। अभ्यास में, ELISPOT परख तेजी से रक्त के नमूनों की एक बड़ी संख्या के निपटने में आसानी की वजह से टीका प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परिधीय रक्त से मानव बी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के तरीकों, इन विट्रो में ASCs में बी कोशिकाओं के भेदभाव, और कुल IgM- और आईजीजी ASCs की मात्रा का ठहराव के लिए ELISPOT के रोजगार यहाँ वर्णित किया जाएगा।
Introduction
बी कोशिकाओं त्रिदोषन प्रतिरोधक क्षमता के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। वे शुरू में अस्थि मज्जा में विकसित करने और इस तरह के रूप में तिल्ली भोले बी कोशिकाओं है, जो लसीकावत् ऊतकों में विस्थापित कर सकते हैं, लिम्फ नोड्स, और टॉन्सिल, आगे विकास के लिए के रूप में रक्त प्रवाह में प्रवेश। एजी मुठभेड़ पर, कुछ भोले बी कोशिकाओं लसीकावत् के रोम, जहां कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं स्मृति बी कोशिकाओं और plasmablasts (पीबीएस) / प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसी) में अंतर कर सकते में विस्थापित। जबकि सबसे पीबीएस / पीसी रक्त प्रवाह में बाहर निकलना, कुछ अंततः अस्थि मज्जा में रहते हैं लंबे समय रहते पीसी 1 में टर्मिनल भेदभाव से गुजरना है। संचलन में बी कोशिकाओं विषम हैं, और स्थिर अवस्था में, पीबीएस / पीसी परिधीय रक्त 2 में दुर्लभ हैं। वंश विशेष सतह मार्कर की उपलब्धता का एक परिणाम के रूप में, प्रवाह cytometry पहचान और परिधीय रक्त में बी-सेल सबसेट के लक्षण वर्णन के लिए एक लोकप्रिय तरीका बन गया है। प्रवाह cytometr की एक विस्तारित आवेदनy एक सेल सॉर्टर समारोह है, जो जुदाई और बी कोशिकाओं की अलग-अलग सबसेट के अलगाव के उच्च शुद्धता के साथ परमिट के अतिरिक्त है। विभिन्न विकासात्मक चरणों में विशिष्ट सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति मानव घूम बी कोशिकाओं आम तौर पर तीन मुख्य उप-जनसंख्या में वर्गीकृत कर रहे हैं के आधार पर:, स्मृति बी कोशिकाओं (CD19 + CD27 + CD38 -) भोले बी कोशिकाओं (- – CD38 CD19 + CD27), और पीबीएस / पीसी (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (चित्रा 1)। स्वभाव से भोले बी कोशिकाओं Ags सामना नहीं किया है। हालांकि, वे आईजीएम + CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि भोले बी कोशिकाओं बी सेल प्रतिजन रिसेप्टर (बीसीआर) -associated अणु (जैसे, CD19, CD20 और CD22) वे अपने इम्युनोग्लोबुलिन प्रदर्शनों की सूची 5 में विषम हैं व्यक्त करने में सजातीय हैं। CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं के बहुमत CD27 में भेदभाव किया जा सकता+ / हाय CD38 + पीबीएस / पीसी 6। इसके अलावा, स्मृति बी कोशिकाओं और पीबीएस / पीसी पॉलीक्लोनल कर रहे हैं और विकास और कार्यात्मक विविधता 4-7 दिखा रहे हैं। संचलन में पीबीएस / पीसी सामान्य रूप से अल्पकालिक होते हैं और CD138 व्यक्त नहीं करते, लेकिन अस्थि मज्जा में बसने के लिए किए गए उन टर्मिनली अंतर और लंबे समय रहते हो जाएगा। टर्मिनली विभेदित पीसी CD138 व्यक्त करने और उनके सतहों पर 8 CD27 अणुओं नीचे विनियमित। चूंकि दोनों पीबीएस और पीसी के पेट स्रावित करने में सक्षम हैं, कई अवसरों में वे सामूहिक रूप से ASCs के रूप में चिह्नित हैं। इसके विपरीत, न तो भोले बी कोशिकाओं और न ही स्मृति बी कोशिकाओं पेट 9-10 की प्रशंसनीय मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं। 10 दिनों जब उचित संस्कृति की स्थिति 6, 11-15 में रखा गया – फिर भी, जब अलग-थलग, दोनों भोले और स्मृति बी कोशिकाओं ASCs में 3 में भेदभाव किया जा सकता है। वास्तव में, ASCs उन सीधे पृथक fr के साथ CD27 और CD38 की इन विट्रो भेदभाव हिस्सेदारी समान सतह भाव से निकाली गईओम परिधीय रक्त 6। इसके अलावा, ASCs इन विट्रो में भेदभाव सतह CD20 का स्तर कम है, उस घूम पीबीएस / पीसी 6 के समान व्यक्त करते हैं। हालांकि संस्कृति व्युत्पन्न ASCs सभी अल्पकालिक होते हैं, वे पेट छिपाना कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि वे कार्यात्मक रूप से सक्षम और त्रिदोषन प्रतिरक्षा करने के लिए योगदान करने के लिए सक्षम हैं।
अब तक सबसे अधिक आवेदन किया है जिसके साथ तरीकों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने के द्वारा दोनों एलिसा और ELISPOT हैं। एलिसा एक 96 अच्छी तरह से थाली आधारित परख है, और यह अक्सर सीरम एजी-विशिष्ट ABS और अन्य analytes (जैसे, साइटोकिन्स) की titers को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह सुविधाजनक और स्केलेबल है। एलिसा एक तरल नमूना 16 में, पेट या इस तरह के सीरम के रूप में अन्य पदार्थों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक ठोस चरण एंजाइम परख का उपयोग करने के लिए बनाया गया है। सीरम ELISAs से readouts व्यापक रूप से शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक उपकरण पुन के अधिग्रहण के लिए आवश्यकएलिसा assays से adouts एक spectrophotometric microplate पाठक है। पाठक अंत उत्पादों को आम तौर हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित का पता लगाने के पेट और उनके विशिष्ट substrates 17 की प्रतिक्रिया से उत्पन्न ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) निर्धारित कर सकते हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रिपोर्टिंग के संबंध में, सीरम अब एलिसा द्वारा निर्धारित स्तर निरूपित करते सामूहिक, लेकिन अलग-अलग नहीं है, शरीर में ASCs का प्रदर्शन। इसके अलावा, एलिसा खाते में स्मृति बी कोशिकाओं है, जो पेट छिपाना नहीं है की भागीदारी लेने के लिए विफल रहता है।
एलिसा तरह, ELISPOT का पता लगाने और परिधीय रक्त के नमूने 17-18 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। ELISPOT एक सैंडविच एलिसा से संबंधित एक तकनीक है। इसे में, कोशिकाओं polyvinylidene difluoride (PVDF) एक अल्पकालिक संस्कृति के लिए microplates 96 अच्छी तरह से की झिल्ली समर्थित कुओं में रखा जाता है। ELISPOT परख एक microplate और developin पर पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन के अनुरूप हैजी प्रत्येक कुएं में PVDF झिल्ली पर धब्बे। एक स्वचालित प्रणाली ELISPOT पाठक या मैनुअल गिनती के लिए एक stereomicroscope की आवश्यकता है। एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने में ELISPOT का मुख्य लाभ ASCs और साइटोकाइन स्रावित कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव में अपनी शानदार संवेदनशीलता है। यह क्रमश: त्रिदोषन और सेलुलर प्रतिरक्षा में उनके कार्यात्मक गतिविधियों की रिपोर्ट। प्रतिरक्षा समारोह की माप में, सीरम अब एलिसा और ELISPOT द्वारा प्रगणित ASCs की संख्या द्वारा निर्धारित स्तर अक्सर सहसंबद्ध होते हैं, लेकिन इन दो assays से डेटा readouts कार्यात्मक निहितार्थ 19-20 में कुछ मतभेद हैं। ELISPOT का मुख्य लाभ यह विधि की अपनी संवेदनशीलता है। जब पेट की उचित isotypes का एक ज्ञात राशि संदर्भ के लिए शामिल किया गया है के रूप में एलिसा द्वारा रिपोर्ट सीरम Ab titers के स्तर पर आयुध डिपो readouts के रूप में प्रस्तुत किया जाता है अर्द्ध मात्रात्मक, रिश्तेदार Ab स्तर denoting, या अधिक मात्रात्मक, एकाग्रता readouts के रूप में। इसके विपरीत, ELISPOT के परिणामों presente हैंब्याज की एक सेल पूल में ASCs की पूर्ण संख्या के रूप में डी (जैसे, unfractionated परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) और PBMCs से शुद्ध बी कोशिकाओं)। ELISPOT एक भी एएससी पता लगा सकते हैं, लेकिन एलिसा पूर्व माप करने के लिए अनुकूलित परख निर्भर सांद्रता तक पहुंचने के लिए ASCs से Ab मात्रा की आवश्यकता है। इसलिए, ELISPOT जाहिर मात्रा का ठहराव की संवेदनशीलता में एलिसा के लिए बेहतर है। इसके अलावा, ELISPOT भी सक्रिय स्मृति बी कोशिकाओं से इन विट्रो विभेदित ASCs बढ़ाता के लिए उपयुक्त है। मेमोरी बी कोशिकाओं पेट छिपाना नहीं है, लेकिन सक्रियण पर ASCs में अंतर कर सकते हैं; वे इसलिए एलिसा द्वारा पता लगाया सीरम पेट के लिए कोई योगदान नहीं है। इस प्रकार, ELISPOT संस्कृति में सक्रियता के बाद स्मृति बी कोशिकाओं घूम की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के माप में पसंद की विधि है। यह लंबी अवधि के त्रिदोषन उन्मुक्ति के रखरखाव की निगरानी के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अलगाव और मानव परिधीय रक्त बी कोशिकाओं की शुद्धि
आम तौर पर, लाल रक्त कोशिकाओं को कुशलता से उठी और lysis बफर (1.2 चरण) द्वारा मंजूरी दी जा सकती। यह आरबीसी lysis 5 मिनट से ज्यादा देर तक बफर के साथ PBMCs सेते लिए म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
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