Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
Kjennetegnet av humoral immunitet er å generere funksjonelle ASCer, som syntetiserer og utskiller Abs spesifikk for et antigen (Ag), slik som en patogen, og blir brukt til vertens forsvar. For kvantitativ bestemmelse av den funksjonelle status av den humorale immunresponsen til et individ, både serum Abs og sirkulerende ASCer blir ofte målt som funksjonelle avlesninger. Hos mennesker er perifert blod den mest praktiske og lett tilgjengelige prøve som kan brukes for bestemmelse av den humorale immunrespons fremkalt ved verten B-celler. Forskjellige B-celleundergrupper, inkludert ASCer, kan bli isolert direkte fra perifert blod via utvalg med avstamning-spesifikk Ab-konjugerte mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Videre kan rensede naive og minne B-celler aktiveres og differensiert i ASCs i kultur. De funksjonelle aktivitetene av ASCer for å bidra til Ab sekresjon kan kvantifiseres ved ELISPOT, som er en metode som konvergerer enzym-koblet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologi for å muliggjøre bestemmelse av de enkelte ASC ved enkeltcellenivå. I praksis har ELISPOT-analysen blitt stadig mer brukt for å evaluere vaksineeffektivitet på grunn av den enkle håndtering av et stort antall blodprøver. Fremgangsmåtene for isolering av humane B-celler fra perifert blod, vil differensiering av B-celler til ASCer in vitro, og anvendelse av ELISPOT for kvantifisering av total IgM- og IgG-ASCer bli beskrevet her.
Introduction
B-celler spiller en sentral rolle i utviklingen av humoral immunitet. De i utgangspunktet utvikle seg i benmargen og inn i blodstrømmen som naive B-celler, som kan migrere inn i lymfevev, slik som milt, lymfeknuter, og mandlene, for videre utvikling. Ved Ag møte, noen naive B-celler vandrer inn lymfoide follikler, hvor Germinal senter B-celler kan differensiere til minne B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Mens de fleste PBS / PC-utgang inn i blodstrømmen, noen til slutt ligge i benmargen til å gjennomgå terminal differensiering i langlivede PCer 1. B-celler i omløp er heterogene, og ved steady state, PBS / PC-er sjeldne i perifert blod 2. Som følge av tilgjengeligheten av avstamning-spesifikke overflatemarkører, strømningscytometri har blitt en populær metode for identifisering og karakterisering av B-celleundergrupper i perifert blod. En utvidet bruk av flyt cytometry er tilsetningen av et cellesorteringsfunksjon, som tillater separering og isolering av de enkelte delmengder av B-celler med høy renhet. På bakgrunn av ekspresjonen av spesifikke overflatereseptorer på forskjellige utviklingsstadier, humane sirkulerende B-celler er generelt klassifisert i tre hoved subpopulasjoner: naive B-celler (CD19 + CD27 – CD38 -), minne-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -) og PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler av natur har ikke møtt Ags. Imidlertid kan de bli differensiert i IgM + CD27 + minne-B-celler. Selv naive B-celler er homogene i å uttrykke B-celle antigen reseptor (BCR) -associated molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i sin immunoglobulin repertoar 5. Flertallet av CD27 + minne-B-celler kan differensieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / PC-6. I tillegg minne B-celler og PBS / PCer er polyklonale og vise utviklings og funksjonell heterogenitet 4-7. PBS / PC-er i omløp er normalt kortvarig og uttrykker ikke CD138, men de som er laget for å slå seg ned i benmargen vil terminalt differensiere og bli langvarige. Terminalt differensiert PCer uttrykke CD138 og ned-regulere CD27 molekyler på overflaten 8. Siden både PBS og PC-er i stand til å skille ut Abs, i mange tilfeller de er kollektivt betegnet som ASCs. I kontrast, kan verken naive B-celler eller minne B-celler produsere betydelige mengder Abs 9-10. Likevel, når isolert, både naive og minne B-celler kan differensieres i ASCs i 3 – 10 dager når den plasseres i de riktige dyrkingsforhold 6, 11-15. Faktisk ASCs avledet fra in vitro differensiering dele lignende overflate uttrykk for CD27 og CD38 med dem direkte isolert from perifert blod 6. I tillegg ASCer differensierte in vitro uttrykker et lavt nivå av overflate CD20, lignende den av sirkulerende PBS / PC 6. Selv om dyrknings-avledede ASCer er alle kortvarig, kan de utskiller Abs, noe som indikerer at de er funksjonelt kompetente og i stand til å bidra til den humorale immunitet.
Både ELISA og ELISPOT er langt de mest anvendt metoder som å skaffe funksjonell informasjon om humoral immunrespons. ELISA er en 96-brønners plate-baserte analysen, og det er ofte brukt for å måle titere av serum Ag-spesifikke Abs og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA er utformet for å bruke et fast-fase enzym-analyse for å påvise tilstedeværelse av ABS eller andre stoffer, slik som serum, i en væskeprøve 16. De avlesninger fra serum ELISA har blitt mye brukt for å representere den immunrespons i kroppen. Et verktøy er nødvendig for kjøp av readouts fra ELISA-analyser er en spektrofotometrisk mikroplateleser. Leseren kan bestemme den optiske tetthet (OD) av sluttproduktene vanligvis resulterer fra reaksjonen av pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert deteksjon Abs og deres spesifikke substrater 17. Med hensyn til å rapportere den humorale immunrespons, serumnivåer Ab bestemt ved ELISA betegne kollektivt, men ikke individuell, utførelse av ASCer i kroppen. I tillegg klarer ELISA for å ta hensyn til deltakelse av minne-B-celler, som ikke skiller ut Abs.
Som ELISA, er ELISPOT en mye brukt metode for påvisning og overvåking av immunrespons i perifere blodprøver 17-18. ELISPOT er en teknikk som er relatert til en sandwich ELISA. I det blir cellene plassert i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-sikkerhets brønner av 96-brønners mikroplater for en kortvarig kultur. ELISPOT-analysen er analog til å utføre Western-blotting på en mikroplate og utvikle ferdigg flekker på PVDF-membran i hver brønn. Et automatisert ELISPOT-lesersystem eller et stereomikroskop for manuell telling er nødvendig. Den største fordelen med ELISPOT i å oppdage en immunrespons er den suverene følsomhet i kvantifisering av ASCs og cytokin-sekresjon celler. Den rapporterer sine funksjonelle aktiviteter i humoral og cellulær immunitet, henholdsvis. I måling av humorale immunfunksjon, blir serumnivåer Ab bestemt ved hjelp av ELISA og antallet ASC oppregnet av ELISPOT ofte korrelert, men dataavlesninger fra disse to analyser har noen forskjeller i funksjonelle konsekvenser 19-20. Den største fordelen med ELISPOT er dens følsomhet for metoden. Nivået av serum-Ab titere som rapportert av ELISA er presentert semi-kvantitativt som OD-avlesninger, betegner den relative Ab nivå, eller mer kvantitativt, som konsentrasjonsavlesninger når en kjent mengde av de riktige isotyper av Abs er tatt med for referanse. I kontrast til resultatene av ELISPOT er presented som det absolutte antall av ASCer i en celle pool av interesse (for eksempel, ikke-fraksjonerte perifere mononukleære blodceller (PBMC) og rensede B-celler fra PBMC). ELISPOT kan oppdage en enkelt ASC, men ELISA krever Ab mengder fra ASCs å nå optimalisert analyseavhengig konsentrasjoner før måling. Derfor er ELISPOT åpenbart bedre enn ELISA i følsomhet for mengdebestemmelse. Videre er ELISPOT også egnet for å kvantifisere de in vitro differensierte ASCer fra aktiverte minne-B-celler. Memory B-celler ikke utskiller Abs men kan differensiere til ASCs ved aktivering; de har derfor ikke bidrar til serum Abs detektert ved ELISA. Således er ELISPOT-metoden for valg ved måling av immunresponsen av sirkulerende hukommelses-B-celler etter aktivering i kultur. Det gir mulighet for overvåking av opprettholdelse av langvarig humoral immunitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering og rensing av humant perifert blod B-cellene
Normalt kan RBC effektivt sprengt og klarert av lysis buffer (trinn 1.2). Det er viktig ikke å inkubere PBMC med RBC lysis buffer lenger enn 5 minutter, som celleviabilitet kan bli påvirket av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC og blodplater samtidig bli fjernet av den følgende protokoll.
Blande friskt fullblod med syre-citrat-dextrose (ACD) buffer (39 mM sitronsyre, 75 mM natriumcitrat, og 135 mM dekstrose,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
