Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten worden veel gebruikt gereedschap voor het bestuderen van eiwit lokalisatie en dynamiek van evenementen zoals het cytoskelet remodeling en vesiculair transport in levende cellen. Kwantitatieve methoden gebruikt chimeer GFP-fusies zijn ontwikkeld voor vele toepassingen; echter GFP enigszins resistent tegen proteolyse, waardoor de fluorescentie blijft in het lysosoom / vacuole, die kwantificering van vracht handel kan belemmeren de endocytische route. Een alternatieve werkwijze voor het kwantificeren endocytose en post-endocytische handel gebeurtenissen maakt gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP dat wordt geblust in zure milieus. Chimère fusie van pHluorin aan de cytoplasmatische staart van transmembraan lading eiwitten leidt tot een demping van fluorescentie bij de oprichting van de lading in multivesiculaire lichamen (MVBs) en levering aan het lysosoom / vacuole lumen. Zo, het doven van vacuolaire fluorescentie vergemakkelijkt kwantificeringcatie van endocytose en het begin van de gebeurtenissen in de endocytische route. Dit artikel beschrijft methoden waarbij pHluorin gemerkte ladingen voor het kwantificeren van endocytose via fluorescentiemicroscopie en populatie gebaseerde assays met flowcytometrie.
Vesiculair transport speelt een belangrijke rol bij het handhaven organel identiteit en functie in eukaryotische cellen, en is een belangrijk mechanisme voor het reguleren van eiwit en membraan samenstelling van individuele cellulaire compartimenten. Op het plasmamembraan, fusie van vesicles exocytose levert nieuwe eiwitten en membranen aan het oppervlak van de cel, terwijl vesicles gegenereerd door middel van endocytose membraan en eiwitten te verwijderen van het oppervlak voor daaropvolgende recycling of richten naar het lysosoom. Aldus endocytose is belangrijk voor nutriënten en reacties op de extracellulaire omgeving. Exocytose en endocytose zijn evenwicht te plasmamembraan oppervlakte te reguleren, en de omzet van de beschadigde eiwitten mogelijk te maken.
Studies in gist en zoogdiercellen zijn een groot aantal eiwitten die betrokken zijn endocytose, evenals meerdere endocytotische wegen die internalisatie specifieke ladingen bevorderen of die handeling vastgesteld in reactie op verschillende environmental omstandigheden. De best bestudeerde pathway is clathrine gemedieerde endocytose (CME), waarin clathrine en cytosolische additionele eiwitten assembleren tot een laag structuur de ontluikende endocytische vesicles stabiliseren. Experimenten in de gist Saccharomyces cerevisiae hebben belangrijke inzichten in de dynamiek en de volgorde van de werving voor vele endocytische eiwitten 1-3 opleverde. Met name wordt de CME machine sterk geconserveerd door evolutie zodanig dat de meeste CME-gerelateerde eiwitten in gist hebben humane orthologen; dus, gist is een belangrijk instrument voor het begrip van de mechanismen van endocytose die zijn geconserveerd in hogere eukaryoten geweest. Bijvoorbeeld, studies met behulp van gist vastgesteld dat de vorming en rijping van CME structuren (als corticale actine vlekken in gist genoemd) omvat de sequentiële rekrutering van veel eiwitten, te beginnen met clathrine en-cargo bindende adapter eiwitten, gevolgd door de aanwerving van extra endocytische accessoire eiwitten,activering van Arp2 / 3-gemedieerde actine polymerisatie, en werving van eiwitten die betrokken zijn bij blaasje splitsing 1,2. Aanwerving van CME machines eiwitten aan actine pleisters corticale is een sterk geordende en stereotiepe proces, en de precieze volgorde van de werving voor veel eiwitten is vastgesteld met betrekking tot andere onderdelen van de CME machines. Belangrijk is, hebben recente studies een vergelijkbare orde van werving voor CME eiwitten op-clathrine gecoate pits in zoogdiercellen 4 bevestigd.
Naast CME vele celtypen bezitten één of meer clathrine afhankelijke endocytose (CIE) pathways die afhankelijk zijn van alternatieve mechanismen vorming vesikel en internalisatie van het plasmamembraan 5-7 promoten. In gist, hebben we onlangs geïdentificeerd een CIE traject dat de kleine GTPase Rho1 en het activeren van guanine nucleotide exchange factor (GEF), ROM1 8,9 gebruikt. Rho1 activeert de formin Bni1 om actine polymerisatie 1 te bevorderen0,11, die nodig is voor deze vorm van clathrine afhankelijke endocytose in gist 12. Bovendien, de α-arrestine eiwitfamilie rekruteren ubiquitine ligase Rsp5 om lading ubiquitinatie en daaropvolgende internalisering bevorderen door CME 13-17, en ook bevorderen lading internalisatie via de CIE route, mogelijk door directe interactie met eiwitten die betrokken zijn CIE 18. Verschillende CIE trajecten bestaan ook in zoogdiercellen, waaronder clathrine-onafhankelijke en fagocytische paden die afhankelijk zijn van de Rho1 ortholoog, RhoA 9,19. De rol van RhoA in zoogdiercellen CIE is slecht begrepen; dus, kunnen studies in gist extra mechanistische inzichten die van toepassing zijn op zoogdieren CIE zijn te verstrekken.
Nauwkeurige kwantificering van endocytische gebeurtenissen kunnen belangrijke informatie over de rol van specifieke eiwitten bij het reguleren van endocytose te bieden, en kunnen de effecten van mutaties op de lading internalisatie of progressio onthullenn door de endocytische route. Hiertoe kan biochemische methoden worden toegepast om ligand opname controleren of snelheden van afbraak van eiwitten endocytische lading te meten. In levende cellen, fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten om ladingen van belang maakt directe visualisatie van vrachtvervoer. Echter, GFP ladingen hebben een beperkt nut voor het kwantificeren van endocytose omdat GFP is resistent tegen afbraak in het lysosoom (of vacuole in gist). Bovendien GFP fluorescentie slechts gedeeltelijk gevoelig voor veranderingen in pH en nog waarneembaar in de vacuole lumen 20,21. Derhalve fluorescentie van het GFP-tag blijft in de vacuole lang nadat de rest van de lading is afgebroken en whole-cell kwantificering lading intensiteit onnauwkeurig zijn als gevolg van langdurige GFP fluorescentie in de vacuole.
Om de nadelen van vacuolaire GFP fluorescentie overwinnen we eerder gebruikt superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP die helder fluoresceert bij neutrale pH, maar verliest fluorescentie in zure omgevingen zoals het lumen van de vacuole / lysosoom 20,22,23. Het plaatsen van een pHluorin tag op de cytoplasmatische staart van endocytische ladingen maakt visualisatie van de ladingen op het plasmamembraan en op de vroege endosomen, waar de pHluorin tag blijft blootgesteld aan het cytoplasma (Figuur 1A). Al in endosomen rijpen, de endosomale sorteren complex die nodig is voor het vervoer (ESCRT) machines pakketten-oppervlak gelokaliseerde ladingen in blaasjes die knop in het lumen van de endosoom, het genereren van multivesiculaire lichamen (MVBs) 24. Voor ladingen die in de interne MVB blaasjes hebben opgenomen, de pHluorin tag kijkt in de richting van het blaasje lumen. Interne MVB blaasjes worden aangezuurd; dus pHluorin-gelabeld lading verliezen fluorescentie op de vroege endosomen als ze volwassen worden in MVBs 20. Daaropvolgende fusie van het MVB de vacuole levert de inhoud MVB luminalevoor de afbraak, blijven en pHluorin labels geblust in het zure milieu van de vacuole lumen.
Dit document bevat gedetailleerde beschrijvingen van de kwantitatieve endocytische assays met behulp van ladingen met cytoplasmatische pHluorin labels in gist. Stammen die pHluorin-tag ladingen kunnen worden gebruikt in kinetische en / of eindpunt assays, afhankelijk van de eigenschappen en handel gedrag van de specifieke lading. Bovendien hebben sommige pHluorin-tag ladingen zijn vatbaar voor high-throughput analysemethoden, waaronder flowcytometrie. Belangrijk is dat de pHluorin tag is een veelzijdig instrument voor het bestuderen van endocytische gebeurtenissen in levende cellen, waardoor kwantificering van endocytose en vergelijking van endocytotische functie in het wild-type en mutante stammen.
Toepassingen van pHluorin voor het kwantificeren van endocytotische gebeurtenissen in gistcellen maakt gebruik van transmembraan ladingen waarin de fluorescente tag gefuseerd met de cytoplasmische staart van het eiwit (Figuur 1A). Voor de hier beschreven assays, ladingen zijn fel tl wanneer de pHluorin tag wordt blootgesteld aan neutrale omgevingen, maar worden gedoofd toen de pHluorin tag tegenkomt zure omstandigheden. Aldus wordt een pHluorin gemerkte endocytische lading gemakkelijk gedetecteerd bij h…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |