出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその変異体は、広くタンパク質の局在や、細胞骨格の再構築と生きた細胞内小胞輸送などのイベントのダイナミクスを研究するためのツールを使用しています。キメラGFP融合物を用いた定量方法は、多くの用途のために開発されています。しかし、GFPは、タンパク質分解に対して多少耐性があるので、その蛍光は、エンドサイトーシス経路に貨物輸送の定量化を妨げる可能性がリソソーム/液胞に持続します。エンドサイトーシスとエンドサイトーシス後の人身売買のイベントを定量化するための別の方法はsuperecliptic pHluorin、酸性環境中で急冷されるGFPのpH感受性の変異体を使用しています。多胞体（MVBs）およびリソソーム/液胞の内腔への配信への貨物の取り込み時に蛍光の減衰における膜貫通貨物タンパク質結果の細胞質尾部にpHluorinのキメラ融合。このように、液胞蛍光の消光はquantifiを容易にエンドサイトーシスとエンドサイトーシス経路における初期の事象のカチオン。本稿では、フローサイトメトリーを用いて、蛍光顕微鏡を介したエンドサイトーシスの定量化のためのpHluorinタグ付き貨物だけでなく、集団ベースのアッセイを使用する方法について説明します。
Introduction
小胞輸送は、真核細胞内小器官の同一性および機能を維持する上で重要な役割を果たし、個々の細胞区画のタンパク質および膜組成を調節するための重要なメカニズムです。エンドサイトーシスを介して生成された小胞は、その後のリサイクルまたはリソソームに標的化するための表面から膜およびタンパク質を除去に対し、原形質膜で、エキソサイトーシス小胞の融合は、細胞の表面に新たなタンパク質や膜を実現します。このように、エンドサイトーシスは、栄養摂取のためおよび細胞外環境への応答のために重要です。エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、形質膜の表面積を調節するため、および損傷を受けたタンパク質の代謝回転を可能にするようにバランスされています。
酵母および哺乳動物細胞での研究には、専用の様々なことに応答して、エンドサイトーシスに関与するタンパク質の大規模な数、ならびに特定の貨物の内在化を促進する複数のエンドサイトーシス経路またはその行為を同定していますvironmental条件。最もよく研究経路は、クラスリンおよびサイトゾルアクセサリータンパク質は、発生期のエンドサイトーシス小胞を安定化させるためにコート構造に集合したクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、です。出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける実験は、力学と多くのエンドサイトーシスタンパク質1-3のための募集のために重要な洞察が得られています。特に、CMEの機械は非常に進化の過程で保存されているような酵母におけるCME関連タンパク質の大部分は人間のオルソログを持っていること。このように、出芽酵母は、高等真核生物に保存されているエンドサイトーシスのメカニズムを理解するための重要なツールとなっています。例えば、出芽酵母を用いた研究では、追加のエンドサイトーシスのアクセサリーの動員に続いて、CME構造（酵母における皮質アクチンパッチと呼ばれる）の形成と成熟がクラスリンと貨物結合アダプタータンパク質で始まる、多くのタンパク質の順次募集を伴う決定しましたタンパク質、ARP2 / 3媒介アクチン重合の活性化、および小胞の切断の1,2に関与するタンパク質の動員。皮質アクチンパッチにCME機械タンパク質の募集は、高度に秩序とステレオタイプのプロセスであり、多くのタンパク質のための募集の正確な順序は、CMEの機械の他の構成要素に関して確立されています。重要なことは、最近の研究では、哺乳動物細胞4でクラスリン被覆ピットでのCMEのタンパク質のための募集の同様の順序を確認しています。
CMEに加えて、多くの細胞型は、原形質膜5-7の小胞形成および内在化を促進するための代替メカニズムに頼る一つ以上のクラスリン非依存性エンドサイトーシス（CIE）の経路を有します。酵母では、我々は最近、低分子量GTPase Rho1とその活性化グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、ROM1 8,9を利用CIE経路を同定しました。 Rho1は、アクチン重合1を促進するためにformin Bni1を活性化させます酵母12でクラスリン非依存性エンドサイトーシスは、このフォームに必要とされる0,11、。また、タンパク質のα-アレスチンファミリーは、CME 13-17を通じて貨物のユビキチン化およびその後の内在化を促進し、またおそらくCIE 18に関与するタンパク質との直接的な相互作用を介して、CIE経路を介して貨物の内在化を促進するために、ユビキチンリガーゼRSP5を募集します。 CIE経路の様々なもRho1オルソログ、RhoAの9,19に依存しているクラスリン依存せず、食作用経路を含めた哺乳動物細胞、中に存在します。哺乳類CIEにおけるRhoAの役割は十分に理解されていません。従って、出芽酵母での研究は、哺乳類のCIEに適用可能な追加の機械的な洞察を提供してもよいです。
エンドサイトーシス事象の正確な定量は、エンドサイトーシスを調節する特定のタンパク質の役割に関する重要な情報を提供することができ、および貨物の内在またはprogressio上の変異の影響を明らかにすることができますエンドサイトーシス経路を介して、n個。この目的のために、生化学的方法は、リガンドの取り込みを監視するために、またはエンドサイトーシス積荷タンパク質の分解の速度を測定するために利用することができます。生細胞において、関心対象の貨物に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びその変異体の融合は、貨物輸送の直接可視化を可能にします。 GFPは、（酵母または液胞）リソソームでの分解に耐性があるのでしかし、GFPタグ貨物は、エンドサイトーシスの定量化のための使用が制限されています。また、GFP蛍光は、pHの変化に部分的にのみ敏感であり、液胞ルーメン20,21内で検出可能なままです。その結果、GFPタグの蛍光は、貨物の残りの部分が劣化したずっと後に液胞に固執し、貨物の強度の全細胞ベースの定量化が原因液胞の長期的なGFP蛍光に不正確になることがあります。
液胞GFP蛍光の欠点を克服するために、我々は、以前にsuperecliptic pHを使用しましたluorin、中性pHで明るく蛍光を発するが、そのようなリソソーム液胞/ 20,22,23の内腔などの酸性環境下で蛍光を失うGFPのpH感受性変異体です。エンドサイトーシス貨物の細胞質尾部にpHluorinタグを配置することは、原形質膜でとpHluorinタグが細胞質（ 図1A）に露出したまま初期エンドソーム、上の荷物の可視化を可能にします。初期エンドソームが成熟するにつれ、エンドソームは、多胞体（MVBs）24を生成し 、エンドソームの内腔に出芽小胞への輸送のために必要な複雑な（ESCRT）機械パッケージ表面局在貨物を仕分け。内部MVB小胞に組み込まれている貨物については、pHluorinタグは小胞内腔に向いています。内部MVB小胞が酸性化されています。彼らはMVBs 20に成熟としてこのように、pHluorinタグ付きカーゴは、初期エンドソームの蛍光を失います。液胞とMVBのその後の融合は、MVB腔の内容を提供します分解のために、とpHluorinタグは液胞内腔の酸性環境中で急冷したまま。
本稿では、酵母における細胞質pHluorinタグで貨物を用いた定量的エンドサイトーシスアッセイの詳細な説明を提供します。 pHluorinタグ貨物を発現する株は、特定の貨物の性質および輸送の挙動に応じて、運動及び/又はエンドポイントアッセイに使用することができます。さらに、いくつかのpHluorinタグ貨物は、フローサイトメトリーなどのハイスループット分析法に適しています。重要なことは、pHluorinタグは、野生型と変異株におけるエンドサイトーシス機能のエンドサイトーシスとの比較の定量化を可能にする、生きた細胞内のエンドサイトーシス事象を研究するための汎用性の高いツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵母細胞におけるエンドサイトーシスイベントの定量化のためのpHluorinのアプリケーションは、蛍光タグは、タンパク質（ 図1A）の細胞質尾部に融合された貫通貨物を利用します。ここに記載のアッセイのために、貨物はpHluorinタグがニュートラルな環境にさらされたときに明るく蛍光であるが、pHluorinタグは酸性条件に遭遇したときに急冷になります。したがって、pHluorinタグ付…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
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