Tillämpningar av pHluorin för kvantitativ, kinetisk och hög kapacitet Analys av Endocytosis i knoppande jäst
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
Grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter används allmänt verktyg för att studera protein lokalisering och dynamik händelser såsom cytoskelettala ombyggnad och vesikulär handel med levande celler. Kvantitativa metoder använder chimära GFP fusioner har utvecklats för många tillämpningar; dock GFP något resistenta mot proteolys, därmed dess fluorescens kvarstår i lysosomen / vakuolen, som kan hindra kvantifiering av last handel i den endocytiska vägen. En alternativ metod för att kvantifiera endocytos och post-endocytiska trafficking händelser utnyttjar superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som släckes i sura miljöer. Chimär fusion av pHluorin till den cytoplasmatiska svansen av translast proteiner resulterar i en dämpning av fluorescens vid inkorporering av lasten i multivesikulära kroppar (MVBs) och leverans till lysosom / vakuol lumen. Således, utsläckning av vakuolär fluorescens underlättar quantifiningen av endocytos och tidiga händelser i endocytiska vägen. Detta dokument beskriver förfaranden som använder pHluorin-märkta last för kvantifiering av endocytos via fluorescensmikroskopi, samt populationsbaserade analyser med hjälp av flödescytometri.
Introduction
Vesikulär trafficking spelar en viktig roll för att upprätthålla organell identitet och funktion i eukaryota celler, och är en viktig mekanism för att reglera protein och membran sammansättningen av enskilda cellulära avdelningar. Vid plasmamembranet, levererar fusion av exocytiska vesiklar nya proteiner och membran på ytan av cellen, medan vesiklar genererade genom endocytos avlägsna membran och proteiner från ytan för efterföljande återanvändning eller målinriktning till lysosomen. Således är viktigt för näringsupptag och för svar på den extracellulära omgivningen endocytos. Exocytos och endocytos balanseras för att reglera plasmamembran yta, och att tillåta omsättning av skadade proteiner.
Studier i jäst och däggdjursceller har identifierat ett stort antal proteiner som är involverade i endocytos, liksom flera endocytiska vägar som främjar internalisering av specifika last eller att agera som svar på en mängd olika svjömässiga förhållanden. Den bästa-studerade reaktionsvägen är clathrin-förmedlad endocytos (CME), i vilken clathrin och cytosoliska accessoriska proteiner montera in ett lager struktur för att stabilisera den begynnande endocytiska vesikeln. Experiment i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har gett viktiga insikter i dynamiken och ordning rekrytering för många endocytiska proteiner 1-3. Noterbart är maskiner och CME starkt konserverad genom evolutionen, så att majoriteten av CME-relaterade proteiner i jäst har mänskliga ortologer; alltså, knoppande jäst har varit ett viktigt verktyg för att förstå mekanismerna för endocytos som är bevarade i högre eukaryoter. Till exempel, studier med användning av knoppande jäst bestämdes att bildning och mognad av CME strukturer (kallad kortikala aktin patchar i jäst) involverar den sekventiella rekrytering av många proteiner, som börjar med clathrin och lastbindande adaptorproteiner, följt av rekrytering av ytterligare endocytiska tillbehöret proteiner,aktivering av Arp2 / 3-medierad aktin polymerisation, och rekrytering av proteiner involverade i vesikler uppdelning 1,2. Rekrytering av CME maskiner proteiner för att kortikala aktin plåster är en mycket beställt och stereotypa process, och den exakta ordningen för rekrytering till många proteiner har fastställts med avseende på andra komponenter i maskiner och CME. Viktigt har nya studier bekräftade en liknande ordning rekrytering för CME proteiner vid clathrin-belagda gropar i däggdjursceller 4.
Förutom CME, många celltyper har en eller flera clathrin oberoende endocytiska (CIE) vägar som är beroende av alternativa mekanismer för att främja vesikelbildning och internalisering från plasmamembranet 5-7. I jäst, nyligen identifierade vi en CIE väg som utnyttjar små GTPas Rho1 och dess aktiverande guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF), Rom1 8,9. Rho1 aktiverar formin Bni1 att främja aktin polymerisation 10,11, vilket krävs för denna form av clathrin oberoende endocytos i jäst 12. Dessutom α-arrestin familj av proteiner rekrytera ubiquitin ligas Rsp5 att främja last ubikvitinering och efterföljande interna genom CME 13-17, och även främja last interna via CIE vägen, eventuellt genom direkt interaktion med proteiner involverade i CIE 18. En mängd olika CIE vägar finns också i däggdjursceller, inklusive clathrin oberoende och fagocytiska vägar som är beroende av Rho1 ortolog, RhoA 9,19. Rollen av RhoA i däggdjur CIE är dåligt känd, således kan studier i knoppande jäst ytterligare mekanistiska insikter som är tillämpliga på däggdjurs CIE.
Exakt kvantifiering av endocytiska händelser kan ge viktig information om de roller specifika proteiner i regleringen endocytos, och kan avslöja effekterna av mutationer på lastinternalisering eller övergång frånn genom den endocytiska reaktionsvägen. För detta ändamål, kan biokemiska metoder användas för att övervaka ligand upptag eller för att mäta hastigheter av nedbrytning av endocytiska cargo-proteiner. I levande celler, fusion av grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter till laster av intresse medger direkt visualisering av godstransport. Men GFP-märkta last är av begränsad användning för kvantifiering av endocytos eftersom GFP är resistent mot nedbrytning i lysosomen (eller vakuolen i jäst). Dessutom är GFP fluorescens endast delvis känsliga för förändringar i pH, och fortfarande går att urskilja i vakuolen lumen 20,21. Följaktligen fluorescens av GFP taggen kvar i vakuolen långt efter resten av lasten har försämrats, och hela cellbaserade kvantifiering av last intensitet kan vara felaktiga på grund av långsiktiga GFP fluorescens i vakuolen.
I syfte att övervinna nackdelarna med vakuolär GFP-fluorescens, vi tidigare använt sig av superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som fluorescerar starkt vid neutralt pH, men förlorar fluorescens i sura miljöer, såsom lumen i vakuolen / lysosomen 20,22,23. Placera en pHluorin tagg på den cytoplasmatiska svansen av endocytiska last medger visualisering av laster på plasmamembranet och på tidiga endosomer, där pHluorin taggen förblir exponerade till cytoplasman (Figur 1A). Så tidigt endosomer mogna, det endosomala sorterings komplexa krävs för transport (ESCRT) maskineripaket yt-lokaliserad last in i vesiklar som knoppas in i lumen av endosomen, generering multivesikulära kroppar (MVBs) 24. För last som har införlivats i den interna MVB vesikler, vetter mot pHluorin tag mot vesikler lumen. Interna MVB vesiklar surgörs; därmed pHluorin-märkta last förlorar fluorescens på tidiga endosomer som de mognar i MVBs 20. Efterföljande fusion av MVB med vakuolen levererar MVB luminala innehålletför nedbrytning förblir och pHluorin taggar släcktes i den sura miljön i vakuolen lumen.
Detta dokument innehåller detaljerade beskrivningar av kvantitativa endocytiska analyser med hjälp av laster med cytoplasmiska pHluorin taggar i jäst. Stammar som uttrycker pHluorin-märkta last kan användas i kinetiska och / eller endpoint analyser, beroende på egenskaper och handel beteende specifika last. Dessutom är vissa pHluorin-märkta last är mottagliga för hög genomströmning analysmetoder, inklusive flödescytometri. Viktigare är pHluorin taggen ett mångsidigt verktyg för att studera endocytiska händelser i levande celler, vilket möjliggör kvantifiering av endocytos och jämförelse av endocytiska funktion i vildtyps- och mutantstammar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpningar av pHluorin för kvantifiering av endocytiska händelser i jästceller använder sig av transmembranlaster i vilka den fluorescerande taggen är fuserade till den cytoplasmatiska svansen av proteinet (Figur 1A). För de analyser som beskrivs här, last är ljust fluorescerande när pHluorin tag utsätts för neutrala miljöer, men blir släcktes när pHluorin taggen möter sura betingelser. Således är en pHluorin-taggat endocytiska last lätt detekteras vid den cytoplasmiska ytan av pla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O’Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O’Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O’Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. . Curr Prot Mol Biol. , (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -. Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -. H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
