JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
면역학 및 감염병학

en<em> In vitro</em> Model af blodhjernebarrieren Brug Impedans Spektroskopi: En Fokus på T-celle-endotel Cell Interaction

Published: December 08, 2016
doi:
10.3791/54592
, , , , ,
1Department of Neurology,University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry,University of Münster

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

Blod-hjerne-barrieren adskiller det systemiske kredsløb fra centralnervesystemet (CNS) 1 – 3 ud. Det giver en fysisk barriere, der hæmmer den frie bevægelighed for celler og udbredelsen af ​​vandopløselige molekyler og beskytter hjernen mod patogener og potentielt skadelige stoffer. Ud over sin barrierefunktion, BBB muliggør levering af ilt og næringsstoffer til hjernen parenkym, der sikrer et velfungerende neuronalt væv. Funktionelle egenskaber af BBB er stærkt reguleret af dens cellulære og acellulære komponenter, med højt specialiseret EC'er er dens vigtigste strukturelement. EC'er af BBB er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​tight junctions (TJ) komplekser, manglen på fenestrationer, ekstremt lav pinocytic aktivitet, og permanent aktive transportmekanismer. Andre dele af BBB EF basalmembran, pericytter indlejring endotelet, astrocytiske ende fødder og = associeret parienchymal basalmembran også bidrage til udvikling, vedligeholdelse og funktion af BBB 2,4 – 6 og sammen med neuroner og mikroglia, danner neurovaskulære enhed (NVU), som gør det muligt velfungerende CNS 7-9.

I en række neurologiske sygdomme, såsom neurodegenerative, inflammatoriske eller infektiøse sygdomme, er funktionen af BBB kompromitteret 2,5,10. Dysregulering af TJ komplekser og molekylære mekanismer transport fører til øget BBB-permeabilitet, leukocyt-ekstravasation, inflammation og neuronbeskadigelse. For at studere BBB egenskaber under sådanne patofysiologiske tilstande, har forskellige in vitro BBB-modeller fastslået 9,11,12. Sammen har de givet værdifuld indsigt i ændringerne i barriere integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Disse modeller anvender endotelceller fra mennesker, mus, rotte, svin eller b forfår oprindelse 13-18; primære endotelceller eller cellelinier dyrkes enten som en monokultur eller sammen med pericyter og / eller astrocytter for at efterligne nærmere BBB in vivo 19 – 25 år. I de senere år har måling af transendotelmigrering elektrisk modstand (TEER) blevet en bredt accepteret redskab til at vurdere endotel barriereegenskaber 26,27.

TEER afspejler impedans til ion flux hen cellemonolaget, og dens fald tilvejebringer et følsomt mål for kompromitteret endothelial barriere integritet og dermed øget permeabilitet. Forskellige TEER målesystemer er blevet udviklet, herunder Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), og real-time-celle analyse 15,28 – 30. TEER afspejler modstanden mod ionstrøm mellem hosliggende EC'er (paracellulær vej) og er direkte proportional medbarriereintegritet. I impedans spektroskopi 27,31, er kompleks samlede impedans (Z) målt, som giver yderligere oplysninger om barriere integritet ved at måle Ccl. CCL angår den kapacitive strøm gennem cellemembranen (transcellulær vej): cellelaget fungerer som en kondensator i den ækvivalente elektriske kredsløb, adskillelse af afgifter på begge sider af membranen og er omvendt proportional med barriere integritet. Når dyrket på permeable indsatser, EC'er klæbe, formere sig og spredes over mikroporøs membran. Dette modstår baggrunden kapacitive strøm af indsatsen (som i sig selv virker som en kondensator), og fører til et fald i kapacitansen, indtil den når sin minimale niveau. Dette efterfølges af etableringen af ​​TJ komplekser, segl fra rummet mellem tilstødende EC'er. Dette begrænser ionstrøm gennem den paracellulære rute, og TEER øges indtil den når sin plateau. Under inflammatoriske tilstande imidlertid endothelial barriere er kompromitteret: TEER falder som TJ komplekser bliver forstyrret og Ccl stiger som den kapacitive komponent af indsatsen stiger igen.

Vores TEER måling bruger den automatiske overvågning celle 32-system: Det følger af princippet om impedans spektroskopi og udvider sine tidligere ansøgninger. Her beskriver vi en in vitro BBB model, der muliggør studiet af barriereegenskaberne, herunder interaktionen af hjernen endotel med immunceller; især aktiverede T-celler. Observeres sådanne patofysiologiske tilstande i autoimmune sygdomme i CNS, såsom multipel sklerose og dens dyremodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis 33 -. 37 Her et afgørende skridt er sjælevandring af encephalitogene, myelin-specifikke T-celler på tværs af BBB. Dette er efterfulgt af deres reaktivering i perivaskulære rum og indtræden i hjerneparenkym, hvor de rekrutterer andre immunceller og migdiat inflammation og efterfølgende demyelinering 1,35,38. Imidlertid molekylære mekanismer for interaktionen mellem sådanne T-celler og endotelceller, de vigtigste bestanddele af BBB, er ikke godt forstået. Vores protokol har til formål at udfylde dette hul og give nye indsigter i konsekvenserne på endotelceller (dvs. barriere integritet og permeabilitet) efter deres direkte kontakt og komplekse samspil med aktiverede T-celler.

Protokollen beskrevet her gør brug af primære musehjerne mikrovaskulære endotelceller dyrket som et monolag på permeable skær med mikroporøse membraner. Endotelceller samdyrkes med CD4 + -T-celler, som kan være præ-aktiverede enten polyklonalt eller et antigen-specifik måde. Co-kultur af MBMECs med præ-aktiverede, men ikke naive T-celler inducerer et fald i TEER og en stigning i Ccl, som tilvejebringer et kvantitativt mål for MBMEC dysfunktion og barrierenedbrydning. teknikkener ikke-invasiv: det bruger indbygget i stedet for spisepind elektroder, som forhindrer større forstyrrelse af EF-monolag; det kan bruges til at overvåge barrierefunktion uden brug af cellemarkører. Det gør kontinuerlige målinger i en automatiseret måde og muliggør en uafhængig vurdering af de to barriere parametre (TEER og CCL) samtidigt over tid. Metoden er også følsom nok til at skelne mellem forskellige niveauer af T-celle aktivering og effekter af sådanne T-celler på EC'er.

Det kan bruges i en lang række funktionelle assays: kan tilsættes forskellige cytokiner og / eller chemokiner impliceret i inflammatoriske processer til co-kultur af MBMECs og T-celler; kan anvendes blokerende antistoffer mod celleadhæsionsmolekyler på enten EF eller T-celle side; og inhibitorer af T-celleaktivering markører eller deres cytolytiske egenskaber kan tilsættes under T-celle-priming eller deres co-kultur med EC'er. Assayet er ligeledes nyttig til T-celle-transmigrationassays, da det kan tjene som en kvalitetskontrol af MBMEC monolag integritet inden tilsætningen af ​​T celler. Alt dette gør denne metode et alsidigt og pålideligt værktøj til at studere BBB in vitro, med fokus på effekten af aktiverede T-celler på EF monolag integritet. Dette er af særlig betydning for at forstå mekanismerne i BBB forstyrrelser i patogenesen af ​​autoimmune sygdomme, såsom MS og dens dyremodel EAE, hvor selvnedbrydende, encephalitogene T-celler krydser BBB og forårsage betændelse og neuronal beskadigelse.

Protocol

For alle eksperimenter blev mus avlet og holdt under specifikke patogenfrie forhold i den centrale dyr facilitet ved universitetet i Münster, efter tyske retningslinjer for dyr pleje. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i dyreeksperimentelle etiske udvalg og godkendt af de lokale myndigheder i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolering og Kultur BEMÆRK: Isoler MBMECs som tidligere beskrevet i detaljer 14 med følgende ændringe…

Representative Results

Figur 1 giver et generelt overblik af in vitro BBB model anvendt til at undersøge interaktionen mellem T-celler og endotelceller. Eksperimentet består af tre store skridt. Det første skridt er isolering af primære MBMECs fra hjernen cortex, og deres kultur i fem dage. Når de når konfluens i celledyrkningspladen, er MBMECs trypsiniseret og podet på permeable skær, som dernæst anbringes i TEER instrumentet. Den TEER og Ccl af MBMECs løbende måles og ove…

Discussion

Flere trin af den beskrevne protokol er afgørende for en vellykket eksperiment. Under den indledende MBMEC isolering og dyrkning, er det afgørende, at arbejdet udføres under sterile betingelser så meget som muligt, for at hindre kontaminering af cellekulturen med svampesporer eller bakterier. For at opnå en ren kultur af EC'er, anbefales det at anvende et medium indeholdende puromycin for de første tre dage, hvilket muliggør overlevelse af EC'er, men ikke andre typer celler (især pericytter) 41,42.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Annika Engbers og Frank Kurth for deres fremragende teknisk support og Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) til nyttige diskussioner om TEER målinger. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 til HW og LK, CRC TR128, projekter A08; Z1 og B01 til LK og HW, og Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (Medical Faculty of Münster) tilskud nummer KL2 / 2015/14 til LK.

Materials

cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  40. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  41. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  42. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  43. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
  44. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  45. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  46. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  47. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  48. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  49. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
  50. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelImpedance SpectroscopyT Cell-endothelial Cell InteractionNeuroimmunologyAutoimmune CNS DisordersEAEPrimary Endothelial Cell CultureT Cell ActivationMultiple SclerosisMBMEC
check_url/kr/54592?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image