Method Article

분리 및 쥐 림프구의 활성화

DOI:

10.3791/54596

⸱

October 30th, 2016

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

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림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

Abstract

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B 세포와 T 세포는 매우 다양한 항원 수용체 레퍼토리를 가지고 있어 거의 모든 침입 병원체에 대해 특정 면역 반응을 일으킬 수 있는 능력을 가지고 있습니다1,2. 이해할 만하게도, 이러한 복잡한 능력은 시기적절하고 공간적으로 조절되는 면역 반응을 보장하기 위해 다양한 세포 과정에 관여하는 많은 수의 분자에 의해 제어됩니다3. 여기에서는 자기 세포 분류 기술을 사용하여 고도로 정제된 쥐 림프구를 신속하게 분리할 수 있는 실험 절차에 대해 설명합니다. 그 결과 정제된 림프구는 면역 블로팅에 의한 자극 시 림프구 신호 전달 능력의 측정4 및 3H-티미딘 혼입 또는 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 라벨링에 의한 증식 능력의 조사와 같은 다양한 시험관 내 또는 생체 내 기능 분석을 수행할 수 있습니다5-7. 조절 림프구와 유전자 변형 림프구의 기능적 능력을 비교하는 것 외에도, 이식된 CFSE 표지 OT-I T 세포를 사용한 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 생체 내에서 항원제시세포(APC)의 T세포 자극 능력을 결정할 수 있습니다.

Introduction

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성숙한 림프구는 일반적으로 개인에게 기존 감염이나 염증이 없는 경우 휴지 상태로 존재합니다. 따라서 in vitro 또는 in vivo 기능 분석을 수행하기 전에 분리 과정에서 림프구의 순진한 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 보장하는 핵심은 불필요한 세포 조작을 제한하는 것입니다.

자기 세포 분류는 항체와 마이크로비즈를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 관심 세포 집단을 풍부하게 합니다. 이 접근 방식에는 두 가지 정화 전략이 있습니다: positive enrichment와 negative depletion. Positive Enrichment는 표적 세포에 결합하는 항체를 사용하여 관심 세포 집단을 농축합니다. 반면에 Negative Depletion은 비표적 세포를 고갈시켜 관심 세포 집단을 남깁니다. 우리 실험실에서는 표적 세포에 대한 항체의 결합이 잠재적으로 세포의 특징과 행동을 변화시킬 수 있기 때문에 긍정적 농축(positive enrichment)보다 음성 고갈(negative deplement)을 선호합니다. 사실, 특정 세포 집단의 분리에 적합한 많은 확립된 세포 표면 마커는 기능적 수용체이기도 합니다.

자기 세포 ....

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Protocol

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모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 조건에서 유지되고 모든 마우스 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시하고있다.

버퍼 및 시약 1. 준비

  1. 55 μM 2- 머 캅토 에탄올을 완료 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 페니실린 (100 IU / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖)을 제조 ).
  2. 별도로, 20 배 균형 소금 용액 (BSS) 주식 1 재고 2를 준비합니다.
    1. 20 배 BSS의 1 개 (1 L 멸균 111 mM의 포도당, 8.8 MM의 인산 칼륨, 26.7 mM의 인산 나트륨)를 준비하고 최종 볼륨 조정하기 전에 20 배 BSS의 1 개에 40 ㎖의 0.5 % 페놀 레드를 추가합니다. 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터.
    2. 20 배 스톡 BSS 2 (25.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 107 mM의 염화칼륨, 2.73 M 나트륨 CH 준비loride 19.6 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1- L 멸균 16.6 mM의 마그네슘 설페이트). 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필....

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Results

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림프구 세포 자기 정화 사용자가 상대적으로 짧은 시간 동안 표적 세포 집단을 정제 할 수있다. 우리 공핍 프로토콜을 사용하여, 정제 후 94.2 % (에 72.8 % (전 정제) 행 (재결합 활성화 유전자 1 (RAG-1) 결핍 생쥐 OT-I) CD8 T 세포의 비율을 증가 할 수 있었다; 도 1a) 4,5. 이러한 정제 림프구는 림프구 증식 및 신호 전달 4,5-을 결정하는 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 예를 들어, 우리는 장갑차의 생체 내 T 세포 자극 능력을 연구 할 야생형 (WT) 및 적합한 항원 5 면역화 돌연변이 (MT) 마우스에 CFSE 표지 된, 항원 특이 적 T 세포를 옮겨서.

우리의 대표 실험에서, 우리는.......

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Discussion

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이 프로토콜에서는, 우리는 림프 기관에서 림프구를 정제하는 과정을 보여줍니다. 자기 비드 정렬을 사용하여 셀 정화가 가능한 고도로 정제 된 표적 세포를 산출 빠르고 간단한 방법이다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

세포 생존 및 세포 수율

체외에서 조혈 계통 세포의 생존을 유지하는 것은 성공적인 및 재현 실험을 보장하는 데 중요합니다. 화학 및 생물학적 시약, 하위 최적의 실험 조건이나 절제 기관의 부적절한 보관 조건은 모든 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 마우스의 적출 후, 림프 기관 얼음과 가능한 빨리 제조 된 단일 세포 현탁액에 저장 될 필요가있다. 세포 현탁액을 고속 원심 또한 피해야한다. 또한, 세포 펠릿 상층 액을 제거 후 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 느슨하게해야합니다. 그것은 아니다피펫으로 매체의 많은 양의 직접 다시.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 교육, 싱가포르 교육부 (AcRF Tier1-RG40 / 13 Tier2-MOE2013 - T2-2-038)에 의해 지원됩니다. 원고는 Obrizus 통신에서 에이미 설리번에 의해 편집되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
RPMI 1640 (L-Glutamine 제외)Gibco31870025
Fetal Bovine SerumHeat 비활성화 
L-글루타민Gibco25030024
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140114
2-메르캅토에탄올Gibco21985023
Anti-CD43 마그네틱 마이크로비즈Miltenyi Biotec130-049-801사전 사용 중 잘 혼합
Streptavidin 마이크로비즈Miltenyi Biotec130-048-101사전 사용
Anti-Annexin V 자석 비즈Miltenyi Biotec130-090-201사용 전 사용 MACS LD를 잘 섞어;
Miltenyi Biotec130-042-901
96-웰 U-바닥 멸균 배양 플레이트Greiner Bio-one650180
96-웰 F-바닥 멸균 배양 플레이트Greiner Bio-one655180
100 μ m 세포 스트레이너 메쉬사용 전 UV 방사선을 사용하여 살균하려면
0.2 μ 엠  멸균 일회용 필터 장치Nalgene567-0020모든 멸균 필터 장치로 대체할 수 있습니다
. CellTrace VioletInvitrogenC34557CTV, 줄여서 CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTFR의 대안
, CFSE
의 대안세포 증식 염료 eFluor 670eBioscience65-0840CPD670, 줄여서 CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26의 대안, CFSE의 대안
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Chemicals
포도당시그마 AldrichG7021
인산칼륨 일염기성 시그마 AldrichP5655
인산나트륨 이염기Sigma AldrichS5136
페놀 레드시그마 AldrichP0290
염화칼슘 이수화물Sigma AldrichC7902
염화칼시그마 알드리치P5405
염화나트륨머크 밀리포어S7653다른 출처에서 사용 가능
마그네슘 육수화물시그마 알드리치M2393
황산마그네슘시그마 알드리치M2643
염화암모늄시그마 알드리치A9434
트리스 베이스
디메틸 설폭사이드시그마 알드리치 D8418
(5- (및 6-) 카르복시 플루 오레 세인 디아세테이트 숙시니 미딜 에스테르 (CFSE)분자 프로브C-1157DMSO
Phorbol 12,13- 디부티 레이트 (PBDU, Phorbol 에스테르)그마 알드리치P1269
A23187 (칼슘 이오노 단)시그마 알드리치C7522
NameCompany 카탈로그 번호코멘트
항체 및 재조합 단백질
CD11b 비오틴(클론 m1/70)Biolegend101204T 세포 고갈 칵테일
CD11c 비오틴(클론 N418)Biolegend117304T 세포 고갈 칵테일
Gr-1 비오틴(클론 N418) RB6-8C5)바이오레전드 108404T세포 고갈 칵테일
Ter119 비오틴(클론 Ter119)바이오레전116204T세포 고갈 칵테일
TCR-&감마; &델타; 비오틴 (클론 GL-3)바이오레전드 118103T 세포 고갈 칵테일
CD19 비오틴 (클론 6D5)바이오 레전115504T 세포 고갈 칵테일
B220 비오틴 (클론 RA3-6B2)바이오 레전103204T 세포 고갈 칵테일
CD49b 비오틴 (클론 DX5)바이오 레전108904T 세포 고갈 칵테일
CD4 비오틴 (클론 GK1.5)바이오 레전드100404T 세포 고갈 칵테일
CD8 비오틴 (클론 53-6.7)Biolegend100704T 세포 고갈 칵테일
F (ab ')2 염소 안티 마우스 IgM (플레이트 코팅)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 & 마이크로; 코팅용 l/웰(96-well)
안티 마우스 CD40 mAb (플레이트 코팅)Pharmingen 55372250 &마이크로; 코팅용 l/웰 (96-웰)
재조합 IL-4ProSpec 
E. coli Serotype 055:B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (클론 클론 OKT3) (플레이트 코팅)eBioscience 16-0037-8550 &마이크로; 코팅용 l/웰 (96-웰)
Anti-CD28 (클론 클론 37.51) (플레이트 코팅)eBioscience 16-0281-8550 &마이크로; l/우물 코팅용 (96-well)
재조합 IL-2ProSpecCyt-370
알부민, OvalbuminSigma AldrichA7641
잘 혼합은 CTY의 대안, CFSE CellTrace Far Red Invitrogen C34564 성 륨 염화에서 재구성 시드 드 드 드 닭 달걀 흰자위의

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
  2. LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  3. Brownlie, R., Zamoy....

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Murine LymphocytesMagnetic Cell SortingB Cell PurificationT Cell PurificationFlow CytometryCFSE LabelingImmunoblottingTritiated Thymidine IncorporationAntigen Presenting CellsMagnetic Micro Beads

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