منهجيات لدراسة<em> B. الرقيقة</em> الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

المجتمعات البكتيرية متعددة الخلايا تلعب أدوارا هامة في البيئات الطبيعية والبشرية، ويمكن أن تكون مفيدة أو ضارة للغاية. ومن المعروف أن هذه المستعمرات متعددة الخلايا كما الأغشية الحيوية، حيث يتم تضمين الخلايا الفردية في المواد البوليمرية خارج الخلية الذات المنتجة (EPS) المصفوفة. العائد على السهم تلتزم بقوة الخلايا على سطح أنها استعمار. أنها بمثابة درع ضد القوات الميكانيكية والكيميائية وإنشاء اتصال وثيق بين الخلايا المجاورة، وتسهيل الاتصالات الخلوية ^1. يمكن مشاهدة بيوفيلم كمجتمع متباينة، حيث تستخدم الخلايا درجة عالية من التنظيم، منسقة عمليات لتنسيق أنشطتها داخل المجتمع، وكذلك عبر الأنواع ^2-5. وكثيرا ما يرتبط الانتقال من العوالق، ووضع حرة المعيشة للنمو إلى حالة بيوفيلم مع العمليات التنموية. وخير مثال هو بكتيريا التربة العصوية الرقيقة موجبة الجرام، وبالتالي على undomeيخدم سلالة sticated كما كائن نموذج قوي لدراسة مراحل النمو مما يؤدي إلى تشكيل بيوفيلم. في هذه البكتيريا وخلايا متحركة تنظيم أنفسهم في هياكل متعددة الخلايا واضح لتنفيذ مهام متخصصة ^4. مجموعة واحدة من الخلايا، المنتجين مصفوفة تفرز exopolysaccharides ^6، بروتين اميلويد الطاسه ^7،8، والبروتين للا مائية سطح BslA ^9،10. وكلها مشاركة في الجمعية العامة للEPS ^11-13.

وبالنظر إلى وفرة من الأغشية الحيوية في المنافذ الطبيعية والبشرية والضرر القاتل المفترض أنها يمكن أن تسبب، هناك حاجة ملحة لايجاد سبل لمنع تكونها. يمكن مثبطات جزيء صغير مساعدة في اكتشاف مسارات تنظيمية جديدة، والانزيمات والبروتينات الهيكلية تشارك في تشكيل بيوفيلم، وبالتالي تعزيز الرؤى في العمليات المعقدة التجمع مجتمع متعدد الخلايا. كما B. الرقيقة هو نموذج المدروس لالحيويتشكيل الفيلم ^14،15، ويمكن استخدامه لتقييم آثار مختلف مثبطات بيوفيلم. تتناول هذه الدراسة أربعة أساليب الأساسية التي هي مفتاح لتقييم استجابة من الأغشية الحيوية لمثبطات جزيء صغير. أولا، للتأكد من أن هذه المثبطات لديها هدف محدد بيوفيلم، والفصل بين تأثير على نمو العوالق من التأثير على تشكيل بيوفيلم أمر بالغ الأهمية. معظم وكلاء المضادة للبكتيريا تستهدف الخلايا في مرحلة النمو العوالق، ولكن الجزيئات التي تستهدف حياة بيوفيلم نادرة. بالإضافة إلى ذلك، كما الجزيئات التي لا تؤثر على نمو العوالق ليست سامة، يمكن أن تقلل من الضغط الانتقائي لصالح المسوخ المقاومة للمضادات الحيوية ^16. على سبيل المثال، عندما يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع الأحماض الأمينية-D أو بعض الجزيئات الأخرى خلية التدخل الجدار، إما بالانزعاج هم أو تفكيكها، ولكن هذه المثبطات فقط تؤثر أقل ما يقال ^12،17 نمو العوالق. في المقابل، العديد من المضادات الحيوية يضعف بشكل كبير نمو العوالق، مع لإيتل أو أي تأثير على تشكيل بيوفيلم ^17.

ثانيا، وضع إطار تجريبي ثابت وقوي لدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة أمر بالغ الأهمية. لاحظنا أن نطاق تركيز نشط من مثبطات جزيء صغير حساس للشروط مسبقة الثقافة والإعداد التجريبية المستخدمة لدراسة تأثير هذه المثبطات جزيء صغير. تقارير مختلفة، لا سيما أولئك الذين يدرسون B. الرقيقة، وكشف الاختلافات في مدى التركيز الذي الأحماض الأمينية-D تمنع تشكيل pellicles – العائمة الأغشية الحيوية البكتيرية ^12،17-19. وتشير النتائج المعروضة هنا أن العوامل التالية تمثل اختلافات في مدى تركيز نشاط: من شروط مسبقة ثقافة (لوغاريتمي ^12،17 مقابل مرحلة نمو ²⁰ في وقت متأخر من ثابتة)، ومتوسط النمو المستخدمة في حالة ما قبل الثقافة (الأغنياء، غير معروف [لوريا مرق، LB] مقابل يعرف [الغلوتامات أحادية الصوديوم-glycerol، MSgg])، ونسبة التلقيح وخصوصا إزالة المتوسطة قبل الثقافة قبل التلقيح. وأظهرت درجة حرارة النمو جليدة ثابت دورا أقل أهمية في نطاق نشاط صغير جزيء المانع D-ليسين، وهو حمض تمثيلي-D الأمينية المستخدمة في هذه الدراسة.

وأخيرا، مرة واحدة يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع مثبطات بيوفيلم محددة، يطلب من وسائل قوية ومفيدة لوصف آثار هذه المثبطات على اللياقة البدنية بيوفيلم. هنا، يتم وصف طريقتين لوصف مستقل تأثير مثبطات جزيء صغير بالتفصيل: (1) تأثير على الخلايا وحيدة داخل مستعمرة بيوفيلم ومقاومتها للمضادات الحيوية. الخلايا في الأغشية الحيوية تكون في العادة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية بالمقارنة مع البكتيريا التي تعيش خالية من ^21-23. رغم أن هذه الظاهرة هي سياقاتها، وغالبا ما تعتبر قدرة EPS للحد من تغلغل المضادات الحيوية كتفسير جذابة ²⁴ </suص>. هذه الطريقة يقيم بقاء خلايا بيوفيلم محددة سلفا بعد التعرض للمواد مضادة للجراثيم. (2) أثر على بنية مستعمرة بيوفيلم، من كبيرة إلى صغيرة الحجم. تتميز المستعمرات بيوفيلم بواسطة هيكلها ثلاثي الأبعاد وجود EPS. باستخدام المجهر الإلكتروني، والتغييرات في شكل الخلية، بنية مستعمرة بيوفيلم والهندسة المعمارية وفرة من EPS يمكن تصور من كبير (ملم) على نطاق صغير (ميكرون).

Protocol

1. تقييم تأثير الصغيرة جزيء المانعون على جليدة وبيوفيلم مستعمرة تشكيل يعد حل 2X من المعرفة الذي يحفز بيوفيلم MSgg المتوسطة 25 دون كلوريد الكالسيوم والحديد (III) هيدرات كلوريد. بعد تصفية التعقيم، إضافة كلوريد الكالسيو?…

Representative Results

فحص جليدة هو أسلوب واحد لدراسة العمليات درجة عالية من التنظيم والحيوية من B. الرقيقة multicellularity. وبالاضافة الى هذا، هي مناسبة لفحص جليدة لاختبار مجموعة وإما شروط مسبقة بداية أو تركيزات جزيء صغير في لوحة multidish واحدة لزراعة الخلايا في تجربة واحدة. ومع ذلك، B. الرقيق…

Discussion

العصوية الرقيقة أشكال قوية ومنظم للغاية الأغشية الحيوية في كل من السائل (pellicles) وعلى وسط صلب (المستعمرات). وبالتالي، فإنه بمثابة كائن نموذجا مثاليا لوصف طريقة عمل مثبطات بيوفيلم محددة. على وسائل الاعلام الصلبة، الخلايا تشكل هياكل متعددة الخلايا مع السمات المميز?…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA