अध्ययन के लिए तरीके<em> बी। subtilis</em> छोटे अणु Biofilm Inhibitors निस्र्पक के लिए एक मॉडल के रूप Biofilms
Summary
This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.
Abstract
This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.
Introduction
बहु सेलुलर बैक्टीरियल समुदायों प्राकृतिक और मानवजनित वातावरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और फायदेमंद या अत्यधिक हानिकारक हो सकता है। ये बहु-कोशिकीय कालोनियों biofilms, जिसमें व्यक्ति की कोशिकाओं का एक स्वयं उत्पादित कोशिकी polymeric पदार्थों (ईपीएस) मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं के रूप में जाना जाता है। ईपीएस दृढ़ता से सतह वे उपनिवेश स्थापित करने की कोशिकाओं पालन करें। वे यांत्रिक और रासायनिक ताकतों के खिलाफ एक ढाल के रूप में सेवा और सेलुलर संचार की सुविधा 1 पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ संपर्क बनाने। एक biofilm एक विभेदित समुदाय, जहां कोशिकाओं को विनियमित अत्यधिक उपयोग के रूप में देखा जा सकता है, प्रजातियों 2-5 भर के रूप में समुदाय के भीतर उनकी गतिविधियों का समन्वय करने के लिए, साथ ही प्रक्रियाओं करवाया। एक biofilm राज्य के लिए एक planktonic, मुक्त रहने वाले विकास के मोड से संक्रमण अक्सर विकास की प्रक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है। एक अच्छा उदाहरण है ग्राम पॉजिटिव मृदा जीवाणु बेसिलस subtilis, और इसलिए एक undome हैsticated तनाव विकासात्मक biofilm गठन के लिए अग्रणी चरणों का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल जीव के रूप में कार्य करता है। इस जीवाणु में, गतिशील कोशिकाओं विशिष्ट बहुकोशिकीय संरचनाओं कि विशेष कार्य 4 बाहर ले जाने में खुद को व्यवस्थित। कोशिकाओं के एक समूह, मैट्रिक्स उत्पादकों exopolysaccharides 6 छिपाना, amyloid प्रोटीन TASA 7,8, और सतह hydrophobicity प्रोटीन BslA 9,10; जो सभी के ईपीएस 11-13 की सभा में भाग लेते हैं।
प्राकृतिक और मानवजनित आलों में biofilms की बहुतायत और ख्यात घातक नुकसान वे पैदा कर सकता है को देखते हुए, एक दबाने उनके निर्माण को रोकने के लिए तरीके खोजने की जरूरत नहीं है। छोटे अणु inhibitors नए नियामक रास्ते, एंजाइम और संरचनात्मक biofilm गठन में शामिल प्रोटीन की खोज में सहायता कर सकते हैं, और इस तरह बहुकोशिकीय समुदाय विधानसभा की जटिल प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि को बढ़ावा देने के। बी के रूप में subtilis जैव के लिए एक अच्छी तरह से अध्ययन मॉडल हैफिल्म निर्माण 14,15, यह विभिन्न biofilm अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन के चार मौलिक तरीकों कि छोटे अणु अवरोधकों को biofilms की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं tackles। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि इन अवरोधकों एक biofilm-विशिष्ट लक्ष्य है, biofilm गठन पर प्रभाव से planktonic विकास पर प्रभाव की जुदाई महत्वपूर्ण है। अधिकांश जीवाणुरोधी एजेंटों उनके planktonic विकास के चरण में कोशिकाओं को लक्षित है, लेकिन अणुओं है कि biofilm जीवन शैली लक्ष्य दुर्लभ हैं। इसके अतिरिक्त, के रूप में अणुओं है कि planktonic विकास को प्रभावित नहीं करते विषाक्त नहीं हैं, वे एंटीबायोटिक प्रतिरोधी म्यूटेंट 16 के पक्ष में चयनात्मक दबाव को कम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, जब biofilms डी-एमिनो एसिड या कुछ अन्य सेल दीवार दखल अणुओं के साथ व्यवहार कर रहे हैं, वे या तो परेशान कर रहे हैं या disassembled, लेकिन इन अवरोधकों केवल हल्का planktonic विकास 12,17 प्रभावित करते हैं। इसके विपरीत, कई एंटीबायोटिक दवाओं के नाटकीय रूप से, planktonic विकास ख़राब एल के साथittle या biofilm गठन 17 पर कोई प्रभाव नहीं।
दूसरा, छोटे अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सुसंगत और मजबूत प्रयोगात्मक ढांचा स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमने देखा है कि छोटे अणु अवरोधकों के सक्रिय एकाग्रता रेंज पूर्व संस्कृति की स्थिति को और प्रयोगात्मक इन छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सेटअप करने के लिए संवेदनशील था। विभिन्न रिपोर्टों, विशेष रूप से उन बी अध्ययन चल बैक्टीरियल biofilms 12,17-19 – subtilis, एकाग्रता रेंज में बदलाव, जिस पर डी-एमिनो एसिड pellicles के गठन को बाधित पता चला। , पूर्व संस्कृति की स्थिति (लघुगणक 12,17 बनाम देर से स्थिर विकास के चरण 20), मध्यम विकास प्री-संस्कृति हालत में इस्तेमाल किया (अमीर: यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि निम्न कारक सक्रिय एकाग्रता रेंज में मतभेद के लिए खाते में अपरिभाषित [Luria शोरबा, पौंड] बनाम परिभाषित [मोनोसोडियम ग्लूटामेट-glycerol, MSgg]), टीका अनुपात और टीका से पहले प्री-संस्कृति के माध्यम से विशेष रूप से हटाने की। स्थिर पतली झिल्ली विकास का तापमान छोटे अणु अवरोध डी-leucine, एक प्रतिनिधि डी-एमिनो एसिड इस अध्ययन में इस्तेमाल की गतिविधि रेंज में एक कम महत्वपूर्ण भूमिका दिखाया।
अंत में, एक बार biofilms विशिष्ट biofilm निरोधक, मजबूत और सूचनात्मक तरीकों biofilm फिटनेस पर इन अवरोधकों के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए आवश्यक हैं के साथ व्यवहार कर रहे हैं। एक biofilm कॉलोनी और रोगाणुरोधी एजेंटों के लिए उनके प्रतिरोध के भीतर एकल कक्षों पर (1) प्रभाव: यहाँ, दो तरीकों स्वतंत्र रूप से छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव को चिह्नित करने के बारे में विस्तार से बताया गया है। Biofilms में कोशिकाओं को आमतौर पर अधिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी जब मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया 21-23 की तुलना में कर रहे हैं। हालांकि इस घटना multifactorial है, ईपीएस की क्षमता एंटीबायोटिक पैठ को कम करने के लिए अक्सर एक अपील स्पष्टीकरण 24 के रूप में माना जाता था </sup>। इस विधि जीवाणुरोधी पदार्थों के प्रदर्शन के बाद पूर्व स्थापित biofilm कोशिकाओं के अस्तित्व का आकलन है। (2) छोटे पैमाने पर करने biofilm कॉलोनी वास्तुकला पर प्रभाव, बड़े से। Biofilm कालोनियों उनके तीन आयामी संरचना और ईपीएस की उपस्थिति की विशेषता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग, सेल आकृति विज्ञान, biofilm कॉलोनी संरचना और वास्तुकला और ईपीएस की बहुतायत में परिवर्तन छोटे पैमाने (माइक्रोन) के लिए बड़े (मिमी) से देखे जा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
बेसिलस subtilis रूपों मजबूत और उच्च संरचित biofilms तरल में दोनों (pellicles) और ठोस माध्यम पर (कालोनियों)। इसलिए, यह विशिष्ट biofilm अवरोधकों की कार्रवाई की विधा को चिह्नित करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव के रूप में कार्य क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.
Materials
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37°C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
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