Summary

研究のための方法論<em> B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての>バイオフィルム

Published: October 09, 2016
doi:

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

多細胞細菌群集は、自然と人為的な環境で重要な役割を果たし、かつ有益であるか、または非常に有害であり得ます。これらの多細胞コロニーを、個々の細胞が自己生産細胞外ポリマー物質(EPS)マトリックス中に埋め込まれている前記バイオフィルムとして知られています。 EPSは強く、彼らが植民地化の表面に細胞を接着します。彼らは、機械的および化学的な力に対するシールドとして機能し、セルラー通信1を容易 、隣接するセルの間の密接な接触を作成します。バイオフィルムは、細胞が高度に制御使用差別コミュニティ、と見ることができる、コミュニティ内だけでなく、種2-5全体で彼らの活動を調整するためのプロセスを画策。バイオフィルム状態への成長のプランクトン、自由生活モードからの移行は、多くの場合、発達過程と関連しています。良い例は、グラム陽性土壌細菌の枯草菌(Bacillus subtilis)、したがってundomeですsticated株は、バイオフィルム形成につながる発達段階を研究するための堅牢なモデル生物としての役割を果たす。この細菌では、運動性の細胞は、特殊なタスク4を実行目立つ多細胞構造に自分自身を整理します。細胞の一つのグループは、マトリックス・プロデューサーはエキソポリサッカライド6を分泌 、アミロイドタンパク質TASA 7,8、および表面疎水性タンパク質BslA 9,10;これらの全ては、EPS 11-13の組み立てに参加しています。

自然と人為的ニッチでのバイオフィルムの豊かさと、彼らが引き起こす可能性が推定される致命的なダメージを考えると、それらの形成を防止するための方法を見つけることが急務です。小分子阻害剤は、バイオフィルム形成に関与する新たな調節経路、酵素および構造タンパク質の発見を補助し、それによって多コミュニティアセンブリの複雑なプロセスにおける洞察を促進することができます。 B.として枯草菌バイオのためのよく研究モデルであります成膜14,15は、様々なバイオフィルム阻害剤の効果を評価するために使用することができます。この研究は、小分子阻害剤に対するバイオフィルムの反応を評価するための主要な4つの基本的な方法に取り組みます。まず、これらの阻害剤はバイオフィルム特有の目標を持っていることを確認するために、バイオフィルム形成に及ぼす影響からプランクトンの成長への影響の分離が重要です。ほとんどの抗菌剤は、それらのプランクトン増殖期の細胞を標的とするが、バイオフィルムのライフスタイルをターゲット分子はまれです。プランクトンの成長に影響を及ぼさない分子は毒性がないとして加えて、彼らは抗生物質耐性変異体16に有利な選択圧を減らすことができます。バイオフィルムは、D-アミノ酸または他の特定の細胞壁干渉分子で処理した場合、例えば、それらは、いずれの乱れまたは分解が、これらの阻害剤は、軽度に浮遊成長12,17に影響を及ぼす。これとは対照的に、多くの抗生物質は劇的リットルで、プランクトンの成長を損ないますittleまたはバイオフィルム形成17に影響はありません。

第二に、小分子の効果を研究するための一貫性と堅牢な実験的な枠組みを確立することが重要です。我々は、小分子阻害剤の有効濃度範囲は、前培養条件およびこれらの小分子阻害剤の効果を研究するために使用される実験に感受性であったことを観察しました。各種レポート、Bを勉強特に浮遊細菌のバイオフィルム12,17-19枯草菌は、D-アミノ酸がペリクルの形成を阻害する濃度範囲の変化を明らかにしました。ここに示された結果は、以下の要因が活性濃度範囲の差を考慮することを示唆している:前培養条件(後期静止20増殖期対対数12,17)、前培養の条件で使用される増殖培地は、(リッチ、定義された対未定義[ルリアブロス、LB] [グルタミン酸ナトリウム- グリセロール、MSgg])、接種率、特に接種前に前培養培地を除去します。静的ペリクル成長の温度は、小分子阻害剤D-ロイシン、本研究で使用した代表D-アミノ酸の活性範囲においてそれほど重要な役割を示しました。

最後に、一度バイオフィルムは、特定のバイオフィルム阻害剤は、堅牢かつ有益な方法は、バイオフィルムのフィットネスにこれらの阻害剤の効果を特徴付けるために必要とされるで処理されます。ここでは、独立して小分子阻害剤の効果を特徴づけるための2つの方法が詳細に記載されている:(1)バイオフィルムコロニー中で単一細胞に作用し、抗菌剤に対する耐性。自由生活細菌21-23と比較した場合、バイオフィルム中の細胞は、典型的には、抗生物質に対してより耐性があります。この現象は多因子ですが、抗生物質の侵入を低減するためのEPSの能力は、多くの場合、魅力的な説明を24としました</suP>。この方法は、抗菌性物質への曝露後の予め確立されたバイオフィルム細胞の生存率を評価します。 (2)バイオフィルムコロニーアーキテクチャへの影響を、大から小スケールへ。バイオフィルムコロニーは、それらの三次元構造およびEPSの存在によって特徴付けられます。小スケール(μm)とし、走査型電子顕微鏡を利用して、細胞形態、バイオフィルムコロニー構造とEPSのアーキテクチャ及び存在量の変化が大きい(ミリメートル)から可視化することができます。

Protocol

1.ペリクルおよびバイオフィルムコロニー形成への小分子阻害剤の影響を評価します塩化カルシウムと鉄を含まない培地定義されたバイオフィルム誘発MSgg 25の2×溶液を調製する(III)六水和物。フィルター滅菌した後、塩化カルシウムを加えます。培地を直接使用する準備ができているか、暗所で4℃で保存することができます。 実験の日に、1×MSgg希釈液を準備します…

Representative Results

ペリクルアッセイは、Bの高度に制御し、動的プロセスを研究するための1つの方法であります枯草菌の多細胞。この他にも、ペリクルアッセイは、1つの実験において、単一の細胞培養multidishプレートに予め始動条件または小分子のいずれかの濃度の範囲を試験するのに適しています。しかし、B.枯草菌ペリクルの形成は前培養条件に敏感である( 例えば 、前培養の…

Discussion

枯草菌フォーム堅牢で高度に構造化されたバイオフィルムの両方の液体中(ペリクル)と固体培地上(コロニー)。したがって、特定のバイオフィルム阻害剤の作用の様式を特徴付けるための理想的なモデル生物として働きます。固形培地に、細胞は、エッジに、中心から放射状にシワのようなペリクルにおいて明らかではない独特の機能を持ったものと多細胞構造を形成します。し…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

Materials

Luria Broth, Lennox Difco 240230
Bacto Agar Difco 214010
potassium phosphate monobasic  Sigma, 136.09 g/mol P0662-500G
potassium phosphate dibasic  Fisher Scientific, 174.18 g/mol BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Fisher Scientific, 209.27 g/mol BP308-500
magnesium chloride hexahydrate  Merck, 203.30 g/mol  1.05833.0250
calcium chloride anhydrous J.T. Baker, 110.98 g/mol 1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma, 197.91 g/mol 31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate  Sigma, 270.30 g/mo) F2877-500G
zinc chloride anhydrous  Acros Organics, 136.29 g/mol 424592500
thiamine hydrochloride Sigma, 337.27 g/mol T1270-100G
L-tryptophan Fisher Scientific, 204.1 g/mol BP395-100
L-phenylalanine Sigma, 165.19 g/mol P5482-100G
L-threonine Sigma, 119.12 g/mol T8625-100G
glycerol anhydrous Bio-Lab Itd 712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate  Sigma, 169.11 g/mol G1626-1KG
D-leucine Sigma, 169.11 g/mol 855448-10G
ethanol anhydrous Gadot 830000054
razor blade Eddison NA
circular cellulose filter papers Whatman, 90 mm 1001-090
glutaraldehyde EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water 16220
paraformaldehyde  EMS, 16% in water 15710
sodium cacodylate Merck, 214.05 g/mol  8.2067
calcium chloride 2-hydrate Merck, 147.02 g/mol  1172113
stub-aluminium mount EMS, sloted head 75230
carbon adhesive tape EMS 77825-12
Shaker 37°C New Brunswick Scientific Innowa42 NA
Centrifuge Eppendorf table top centrifuge 5424 NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip Branson NA
Incubator 30 °C Binder NA
Incubator 23 °C Binder NA
Filter System, 500 ml, polystyrene Cornig Incorporated NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II Boekel NA
S150 Sputter Coater  Edwards NA
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC NA
Environmental Scanning Electron Microscope XL30 ESEM FEG Philips (FEI) NA

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Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp. (116), e54612, doi:10.3791/54612 (2016).

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