Metoder for å studere<em> B. subtilis</em> Biofilm som en modell for å karakter lite molekyl Biofilm hemmere

Summary

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Abstract

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Introduction

Flercellede bakteriesamfunn spille viktige roller i naturlige og menneskeskapte miljøer, og kan være gunstig eller meget skadelig. Disse flercellede kolonier er kjent som biofilm, hvor de enkelte cellene er innebygd i en egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) matrise. EPS sterkt holde cellene til overflaten de kolonisere. De fungerer som et skjold mot mekaniske og kjemiske krefter og skape nær kontakt mellom nabocellene, tilrettelegging for mobil kommunikasjon ^1. En biofilm kan sees på som et differensiert samfunn, der cellene bruker svært regulert, orkestrert prosesser for å samordne sine aktiviteter i samfunnet, samt over arter ^2-5. Overgangen fra en planktoniske, frittlevende modus for vekst til en biofilm tilstand er ofte forbundet med utviklingsmessige prosesser. Et godt eksempel er de Gram-positive jord bakterien Bacillus subtilis, og derfor en helst undomesticated belastning fungerer som en robust modell organisme for å studere utviklingsstadier som fører til biofilmdannelse. I denne bakterien, bevegelige celler organisere seg i iøynefallende flercellede strukturer som utfører spesialiserte oppgaver ^4. En gruppe av celler, matrise-produsenter utskille exopolysaccharides ^6, den amyloidprotein TASA ^7,8, og overflaten hydrofobisitet proteinet BslA ^9,10; som alle deltar i sammenstillingen av EPS ^11-13.

Gitt overflod av biofilm i naturlige og menneskeskapte nisjer og den antatte dødelig skade de kan forårsake, er det et stort behov for å finne måter å hindre deres dannelse. Lavmolekylære inhibitorer kan hjelpe i oppdagelsen av nye regulatoriske trasé, enzymer og strukturelle proteiner involvert i biofilmdannelse, og dermed fremme innsikt i de komplekse prosesser av flercellet samfunnet forsamlingen. Som B. subtilis er et godt studert modell for biofilmdannelse ^14,15, kan det brukes til å vurdere effekten av ulike biofilm hemmere. Denne studien takler fire grunnleggende metoder som er viktige for å vurdere responsen av biofilm til små molekyl hemmere. Først, for å sikre at disse inhibitorene har en biofilm-bestemt mål, er separasjon av effekten på planktoniske vekst fra effekten på biofilmdannelse kritisk. De fleste antibakterielle midler målrette celler i sin planktoniske vekstfase, men molekyler som er rettet mot biofilm livsstil er sjeldne. I tillegg, som molekyler som ikke påvirker planktoniske vekst ikke er giftige, kan de redusere selektivt trykk som favoriserer antibiotika resistente mutanter ^16. For eksempel, når biofilmer er behandlet med D-aminosyrer eller visse andre cellevegg-forstyrrende molekyler, er de enten forstyrret eller demontert, men disse inhibitorene bare mildt påvirke planktoniske vekst ^12,17. I kontrast til mange antibiotika dramatisk svekke planktoniske vekst, med little eller ingen effekt på biofilmdannelse ^17.

For det andre, etablere en konsistent og robust rammeverk eksperimentelt for å studere effekten av de små molekyler er avgjørende. Vi har observert at den aktive konsentrasjonsområdet av lavmolekylære inhibitorer var følsomme for pre-kulturbetingelser og til det eksperimentelle oppsettet som brukes for å studere effekten av disse lavmolekylære inhibitorer. Ulike rapporter, spesielt de som studerer B. subtilis, avslørte variasjoner i konsentrasjonsområdet ved hvilket D-aminosyrer hemmer dannelsen av pellicles – de flytende bakterielle biofilmer ^12,17-19. Resultatene presentert her antyder at de følgende faktorer ta hensyn til forskjeller i den aktive konsentrasjonsområdet: pre-dyrkningsbetingelser (logaritmisk ^12,17 versus sene stasjonære vekstfase ^20), vekstmediet som brukes i den pre-kulturen tilstand (rik, undefined [Luria buljong, LB] versus definert [mononatriumglutamat-glycerol, MSgg]), inokuleringen forholdet og spesielt fjerning av pre-kulturmediet før inokulasjon. Temperaturen av statiske hinne vekst viste en mindre viktig rolle i aktiviteten rekkevidde av den lille molekyl-inhibitor D-leucin, et representativt D-aminosyre anvendt i denne studien.

Til slutt, når biofilmer behandles med spesifikke biofilm-inhibitorer, robuste og informative metoder er nødvendig for å karakterisere virkningene av disse inhibitorene i biofilm kondisjon. Her er to metoder for uavhengig å karakterisere virkningen av lavmolekylære inhibitorer beskrevet i detalj: (1) Effekten på enkeltceller i løpet av en biofilm koloni og deres motstand mot antimikrobielle midler. Celler i biofilmer vanligvis er mer resistente mot antibiotika i forhold til frittlevende bakterier ^21-23. Selv om dette fenomen er multifaktoriell, ble evnen til EPS for å redusere antibiotika penetrering ofte betraktet som en tiltalende forklaring ²⁴ </sup>. Denne fremgangsmåte vurderer overlevelsen av pre-etablerte biofilm-celler etter eksponering for antibakterielle stoffer. (2) Virkning på biofilm-koloni-arkitektur, fra store til den lille målestokk. Biofilm kolonier er karakterisert ved sin tredimensjonale struktur og nærværet av EPS. Ved å benytte skanning elektronmikroskopi, kan endringer i cellemorfologi, biofilm koloni struktur og arkitekturen og overflod av EPS bli visualisert fra det store (mm) til den lille skalaen (um).

Protocol

1. vurdere effekten av små molekyl hemmere på pellicle og Biofilm Colony Formation Forbered en 2x løsning av definert biofilm-induserende MSgg medium 25 uten kalsiumklorid og jern (III) klorid heksahydrat. Etter filter sterilisering, legger kalsiumklorid. Mediet er klar til bruk direkte eller den kan lagres ved 4 ° C i mørket. Forbered 1x MSgg fortynning på dagen for forsøket. Fortynn 2x MSgg medium til 1x med sterilt destillert vann (pellicles) eller sterilt 3% varm (80 ?…

Representative Results

Pellicle analysen er en metode for å studere strengt regulerte og dynamiske prosesser av B. subtilis multicellularity. I tillegg til dette er pellicle analyse egnet for å teste en rekke av enten pre-startforhold eller små molekyl-konsentrasjoner i en enkelt celle-kultur multidish plate i ett eksperiment. Imidlertid B. subtilis pellicle formasjonen er følsom for pre-dyrkingsbetingelsene (for eksempel vekstmedium av pre-kulturen og dens vekstfase), inokuleringen forholdet og fjerningen av de…

Discussion

Bacillus subtilis former robuste og svært strukturerte biofilm både i flytende (pellicles) og på fast medium (kolonier). Derfor fungerer den som en ideell modell organisme for å karakterisere virknings av spesifikke biofilm hemmere. På faste medier, cellene danner flercellede strukturer med særpreg som ikke er tydelig i pellicles, som rynker som stråler ut fra sentrum til kanten. Dermed pellicles og kolonier er komplementære systemer for å studere B. subtilis multicellularity.

<p class="jo…

Materials

Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher Scientific, 209.27 g/mol	BP308-500
magnesium chloride hexahydrate	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
calcium chloride anhydrous	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
iron(III) chloride hexahydrate	Sigma, 270.30 g/mo)	F2877-500G
zinc chloride anhydrous	Acros Organics, 136.29 g/mol	424592500
thiamine hydrochloride	Sigma, 337.27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-phenylalanine	Sigma, 165.19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119.12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrous	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamic acid monosodium salts hydrate	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrous	Gadot	830000054
razor blade	Eddison	NA
circular cellulose filter papers	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
sodium cacodylate	Merck, 214.05 g/mol	8.2067
calcium chloride 2-hydrate	Merck, 147.02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
carbon adhesive tape	EMS	77825-12
Shaker 37°C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter System, 500 ml, polystyrene	Cornig Incorporated	NA
Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA