से फ्लो आधारित एन.के. सेल कार्यों की निगरानी के लिए परख
Summary
एक सरल और विश्वसनीय विधि यहाँ वर्णित है ऐसे degranulation, साइटोकाइन और विभिन्न एन.के. सेल सबसेट के भीतर केमोकाइन उत्पादन के रूप में एन.के. सेल कार्यों का एक सेट का विश्लेषण करने के लिए।
Abstract
Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.
Introduction
सहज प्रतिरक्षा प्रणाली प्राकृतिक किलर के रूप में हिस्सा कोशिकाओं (एन.के.) वायरस से संक्रमित या malignantly बदल कोशिकाओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में योगदान। निरोधात्मक और सक्रिय रिसेप्टर्स की एक प्रणाली उन्हें टी कोशिकाओं के विपरीत पूर्व के प्रतिजन भड़काना बिना स्वस्थ और बदल कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए सक्षम बनाता है। पर लक्ष्य सेल मुठभेड़ एन.के. कोशिकाओं को अपने लक्ष्य को मारने के लिए प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन में उनके साइटोटोक्सिक कणिकाओं (जैसे, perforin, granzymes) की सामग्री जारी। इसके अलावा, एन.के. कोशिकाओं का उत्पादन और साइटोकिन्स के विभिन्न प्रकार (जैसे, interferon- γ: IFN-γ; ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α: TNF-α) छिपाना: लक्ष्य सेल पर (एमआईपी-1β जैसे, मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन 1β) और chemokines बातचीत या साइटोकाइन उत्तेजना 1।
ऐसे cytotoxicity, केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन के रूप में पर्याप्त एन.के. सेल कार्यों विविध जिले के भाग्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता हैआसान बनाता है। ल्यूकेमिया के रोगियों के पतन दरों में वृद्धि हुई दिखाता है कि वे निदान पर एक दोषपूर्ण एन.के. सेल प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन कम हो IFN-γ उत्पादन और एन.के. सेल रिसेप्टर्स 2 को सक्रिय करने की कम अभिव्यक्ति से मिलकर। एन.के. सेल नंबर और लक्ष्य सेल बातचीत पर साइटोकाइन उत्पादन सहित समारोह का एक शीघ्र स्वास्थ्य लाभ के लिए एक कम पलटा और अनुवांशिक रूप से भिन्न स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण 3 प्राप्त रोगियों में सुधार जीवित रहने की दर के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, हेपेटाइटिस सी वायरस से संक्रमित रोगियों में इंटरफेरॉन चिकित्सा की दीक्षा पर परिधीय एन.के. कोशिकाओं की क्षमता degranulation गैर responders 4 की तुलना में जल्दी responders में मजबूत है। एन.के. सेल नंबर (> 80 / μl) 15 दिन पर लिंफोमा या मल्टिपल मायलोमा से पीड़ित रोगियों में ऑटोलॉगस स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (autoSCT) के बाद एक बेहतर प्रगति स्वतंत्र और समग्र अस्तित्व 5 के लिए भविष्य कहनेवाला हैं। मेलेनोमा रोगियों में टी सेल की अभिव्यक्ति immunoglobulin- और mucin-डोमेन-containinजी अणु-3 (टिम-3), एन.के. कोशिकाओं पर एक प्रतिरक्षा नियामक प्रोटीन, रोग और रोग का निदान चरण 6 के साथ संबद्ध।
वैज्ञानिकों ने पिछले दशकों के दौरान एन.के. सेल कार्यों पर नजर रखी है। प्रायर भड़काना बिना ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ एन.के. सेल cytotoxicity के प्रारंभिक विश्लेषण एक 51 करोड़ रिलीज परख 7 का उपयोग कर संबोधित किया। अभी हाल ही में वैज्ञानिकों का विस्तार एन.के. कोशिकाओं 8 की cytotoxicity मूल्यांकन करने के लिए एक गैर रेडियोधर्मी विधि विकसित की है। साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन अक्सर एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) तकनीक 9,10 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है। पिछले दशक के दौरान इन तरीकों से फ्लो आधारित assays से पूरित कर दिया है। पारंपरिक सतह धुंधला प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में प्रोटीन परिवहन अवरोधकों (जैसे, brefeldin ए और monensin) और सेल permeabilization तरीकों का उपयोग विभिन्न विशिष्ट लसीका में केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए वैज्ञानिकों के लिए सक्षम हैocyte सबसेट (जैसे, टी, बी या एन.के. कोशिकाओं) 11। इसके अलावा, अलग से फ्लो आधारित assays टी और एन.के. सेल cytotoxicity की निगरानी के लिए विकसित किया गया है। 2004 में ऑल्टर एट अल। साइटोटोक्सिक कणिकाओं 12 के degranulation के लिए एक मार्कर के रूप में लक्ष्य सेल मुठभेड़ पर एन.के. कोशिकाओं पर lysosome जुड़े प्रोटीन CD107a (Lamp1) की सतह अभिव्यक्ति का वर्णन किया। चूंकि अलग fluorochromes और मल्टी चैनल प्रवाह cytometers की एक विस्तृत श्रृंखला हमारे दिनों में उपलब्ध हैं, यह संभव हो गया है साथ ही साथ विभिन्न एन.के. सेल सबसेट में विविध एन.के. सेल कार्यों (cytotoxicity, साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन) की निगरानी के लिए। यह स्थितियों में, जहां नमूने का आकार सीमित है, जैसे में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है, बायोप्सी या क्षाररागीश्वेतकोशिकाल्पता से पीड़ित रोगियों के रक्त के नमूनों में।
वैश्विक एन.के. सेल कार्यों का परीक्षण करने के लिए, अलग से फ्लो आधारित assays कुशलता से जोड़ा जा सकता है। Theorell एट अल। Hea से प्रेरित एन.के. कोशिकाओंट्यूमर सेल लाइन K562 के साथ lthy दाताओं और 13 के माध्यम से प्रवाह cytometry एन.के. सेल degranulation, अंदर-बाहर संकेत और केमोकाइन उत्पादन का विश्लेषण किया। हाल ही में एन.के. सेल उपसमूहों, phenotypes और ट्यूमर के रोगियों में कार्यों autoSCT दौरान प्रवाह cytometry आधारित assays का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। यह प्रदर्शन किया गया है कि एन.के. कोशिकाओं degranulate और autoSCT 11 के बाद बहुत जल्दी समय बिंदुओं पर ट्यूमर सेल मान्यता पर साइटोकिन्स / chemokines का उत्पादन करने में सक्षम थे।
यहाँ एक प्रोटोकॉल degranulation क्षमता, केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन सहित ट्यूमर कोशिकाओं को एक से फ्लो आधारित परख के लिए यह संभव विभिन्न सबसेट में एन.के. सेल कार्यों की निगरानी के लिए एक साथ आता है कि प्रयोग के साथ बातचीत पर एन.के. सेल कार्यों का मूल्यांकन करने में वर्णित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित विधि स्वस्थ दाताओं या रोगियों के पूरे रक्त के नमूनों से एन.के. सेल कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक आसान, तेज और विश्वसनीय तरीका है। समय लेने वाली घनत्व ढाल centrifugation, जो कई अन्य शुद्धि तरीकों 15 के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.
Materials
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0,4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
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