Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

Summary

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Abstract

After intracerebral infection with the Theiler’s Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introduction

de Theiler murinos Vírus da Encefalomielite (TMEV) é um vírus de ARN de cadeia simples que neurotrópico persistentemente infecta o sistema nervoso central de murino (SNC). Em ratinhos susceptíveis, a infecção com TMEV provoca, uma doença desmielinizante imunomediada-progressiva crónica, conhecida como doença desmielinizante induzida por TMEV (TMEV-DDI). A infecção experimental de ratinhos leva um curso da doença que se assemelha observada em formas progressivas de esclerose múltipla (EM). TMEV-DID é caracterizada por duas fases distintas: a fase aguda e a fase crónica. A fase aguda é, normalmente um ^1,2 encefalite subclínica leve. A segunda fase, crónica, começando cerca de um mês após a infecção, é composto por uma deficiência lentamente progressiva caracterizada por desmielinização, inflamação e axonal ^1,2 danos. A fraqueza observada em ratos está associada a espasticidade e, ocasionalmente, graves espasmos tônico.

Porque há atualmente nenhuma medications para melhorar a incapacidade progressiva em pacientes, os investigadores estão particularmente atraídos por TMEV-IDD, o que representa um modelo animal ideal para o acompanhamento do impacto das drogas modificadoras da doença na progressão da doença. No entanto, em ratinhos, bem como em pacientes com esclerose múltipla, a monitorização da progressão da incapacidade requer uma observação clínica contínua ao longo de períodos de tempo prolongados. Em camundongos, monitorização a longo prazo para a progressão de incapacidade pode ser realizado com o teste de desempenho rotarod.

O teste de desempenho Rotarod é um teste comportamental padrão que avalia funções associadas ao motor, como coordenação, equilíbrio e fadiga em roedores. Os ratos têm a manter o equilíbrio em uma haste de giro, que é rotativa em aceleração contínua; latência do tempo de queda a partir dessa haste é gravado. Os animais com disfunção neurológica é incapaz de permanecer na haste rotativa desde que controles, e eles normalmente caem quando a velocidade de rotação é superior à suacapacidade motora. O comprometimento mais neurológica os animais têm, quanto mais cedo eles cair a vara, e quanto menor a latência é o tempo.

A vantagem do teste de rotarod ao longo dos sistemas de pontuação visuais tradicionais é que ele gera um objetivo, mensurável variável o tempo de latência que pode finalmente ser utilizada para análises estatísticas para quantificar os efeitos das terapias e procedimentos experimentais ^3.

No Laboratório de Neuroimunologia (LONI) em Dartmouth, os ratos são submetidos a um protocolo de adaptação, onde são testados antes da infecção TMEV, a fim de familiarizá-los com a máquina e para avaliar a sua "base" a coordenação normal de equilíbrio e controle motor ^{4, 5.} Uma vez que a linha de base é estabelecida e os ratinhos são infectados com TMEV, eles são testados uma vez ou duas vezes por semana ao longo de um período de vários meses. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, permitindo assim uma avaliação dao declínio do equilíbrio, coordenação e controle motor durante todo o curso da doença desmielinizante.

Várias centenas de TMEV-DDI e tratados de forma simulada os ratos foram testados até agora para disfunção neurológica em Dartmouth. Estes ratinhos tinham recebido vários imunomoduladores, mas nenhum agente farmacológico foi encontrado para ser eficaz no melhoramento da progressão da incapacidade ^6,7. O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem como caracterizar o comprometimento neurológico progressivo apresentado por ratos TMEV-DDI. Em particular, o protocolo oferece recomendações de parâmetros de teste específicos acredita-se ser geralmente adequados para estudar incapacidade neurológica em ratinhos TMEV-DID utilizando o teste de rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar (1) a relevância deste modelo de rato para progressiva MS e (2) a sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, tais como MS. Claramente, oteste de desempenho Rotarod e a corrente de protocolo de parâmetros e de teste optimizados não só são úteis na detecção de incapacidade neurológica progressiva no modelo de ratinho TMEV-DID, mas são também úteis na detecção de deficiências em outros modelos de ratinho genética induzida por vírus e / ou de doenças neurodegenerativas.

Protocol

Todo o trabalho de animais utiliza protocolos revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Geisel Faculdade de Medicina de Dartmouth. 1. O Modelo rato A indução da doença desmielinizante TMEV Induzida Mover as gaiolas contendo SJL feminina ratos de 4 a 6 semanas de idade / jhan do rack para um espaço de trabalho confortável. Marque a ratos (por exemplo, com uma etiqueta de orelha ou punção da orelha) pa…

Representative Results

O objectivo desta experiência representativa foi comparar a incapacidade neurológica induzida pela estirpe Daniels (DA) e tensão de feijão de TMEV. Para efeitos do presente estudo, um grupo de 32 ratinhos fêmea SJL foram infectados por via intracraniana com TMEV, quer da estirpe DA (n = 16) ou a estirpe de feijão (n = 16), e os seus sinais clínicos foram monitorizados ao longo do tempo. Um grupo adicional de 20 ratos foi tratado simulada (ou seja, solução salina foi inj…

Discussion

Despite some limitations, the Rotarod performance test represents an important tool for assessing motor function and dysfunction in TMEV-IDD as well as the effect of pharmacological interventions on disability progression in mice.

The Rotarod test was first described in 1957 as a tool for measuring neurological deficits in rodents¹¹. Rodents have to walk on a rotating rod, with increasing rotating speed, and try to avoid falling to the ground. The latency to fall is recorded and use…

Materials

Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 week old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29g x 0.5cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M