Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Summary

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

L' angiogenèse est le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir d' un réseau vasculaire préexistant ¹ et est le centre de recherche en cours dans de nombreux domaines allant du développement normal de la maladie. Ce processus dynamique implique la prolifération et la migration des cellules endothéliales (EC) et le recrutement des pericytes pour construire un tube vasculaire qui est dirigée vers le site qui a besoin d' oxygène et de nutriments livraison ^2. Pour étudier ce processus nécessite une analyse aussi dynamique, le plus important qui peut récapituler le caractère tridimensionnel de la formation du tube. Les essais in vitro de la matrice 3D ont été développés pour répondre à ce besoin et ont bien fonctionné pour permettre aux chercheurs de définir les étapes discrètes dans l' espace et le temps dans lequel l' angiogenèse a lieu ^{3, 4, 5, 6.} Cependant, ces modèles in vitro de la matrice 3D sont limitées à l' étude des navires non-perfusé uned manquent donc des éléments essentiels pertinents pour le processus de l' angiogenèse (par exemple, circulant croissance et facteurs inhibiteurs, la tension contre – nature / forces à travers le lit vasculaire) et ne parviennent pas à simuler l'environnement complexe présent dans les tissus vivants. Pour remédier à cette limitation, plusieurs essais in vivo de l' angiogenèse ont été mis au point ^7, y compris le bouchon dosage de gel de matrice qui sera l'objet de notre rapport ^{8, 9.}

Le dosage de bouchon de gel de matrice est un test in vivo bien établi dans l' angiogenèse qui fait appel à des chercheurs car il offre une plate – forme robuste pour tester les rôles des différentes cellules et de substances dans l' angiogenèse. gel de Matrix est une solution de la membrane basale disponible dans le commerce qui est sécrétée par la lignée cellulaire de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) qui se solidifie en une matière analogue à un gel à 37 ° C. Le gel de la matrice peut être mélangée avec des cellules et / ou des substances telles que des facteurs de croissance et injeCTED sous-cutanée dans la souris. L'hôte CEs va envahir le bouchon de plus de 14 jours, former un réseau vasculaire, et devenir perfusé avec le sang de l'hôte. À ce jour, les plug essais de gel de la matrice ont toutefois porté exclusivement sur l'étude du comportement des cellules endothéliales lors de l'angiogenèse, au meilleur de notre connaissance, aucun effort n'a encore été faite pour déterminer si ce test peut être utilisé pour la co-culture de cellules endothéliales et péricytes pour étudier comment ces deux types de cellules interagissent au cours de l'angiogenèse. Plus précisément, la compréhension de la relation entre les CEs et péricytes est précieux pour l' étude des maladies où la perte de vaisseaux sanguins est pathologique, y compris microvasculaire ischémie et la maladie vasculaire périphérique ^{10, 11, 12.}

Ici, nous décrivons un protocole qui introduit péricytes d'origine humaine au mélange de gel de matrice avec CEs humaine et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF). Ce mélange peut ensuite être injecté par voie sous cutanée in le dos de souris SCID pour permettre la formation de, péricytes enduits, les navires hybrides entièrement fonctionnels. Notre protocole décrit comment préparer des fiches de gel de matrice contenant CEs humaines avec ou sans péricytes humains, le placement dans des souris SCID et la façon d'analyser les coupes histologiques critères d'angiogenèse critiques.

Protocol

Déclaration d'éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'école de médecine de l'Université de Stanford. NOTE: Les animaux sont sous anesthésie avec 3% d' isoflurane de vaporisateur et 3% fourniture de gaz O 2. L'utilisation de vétérinaire pommade sur les yeux peut aider à prévenir la sécheresse sous anesthésie. 1. Préparation des cellules Cultivez e…

Representative Results

Représentant H & E et immunofluorescence de sections de bouchon de gel de la matrice sont présentés dans la figure 2. Les articles de la CE uniquement les fiches présentent certains navires qui ne sont généralement pas perfusées avec du sang (Figure 2 en haut à gauche, flèches noires) , tandis que les bouchons contenant à la fois CEs et péricytes afficher plusieurs perfusé les navires avec des diamètres plus grands et une couverture comp…

Discussion

Le bouchon de gel dosage de la matrice est avérée être un moyen pratique et efficace d'évaluer la régulation des gènes dans l' angiogenèse, angiogéniques et anti – angiogéniques in vivo, et pour compléter les tests in vitro. Ici, nous décrivons en détail un nouveau bouchon essai de gel de la matrice de l'angiogenèse humaine qui étudie l'interaction entre les cellules et les pericytes endothéliales lors de la formation des vaisseaux.

Il y a que…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907