우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.
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방법 논문
마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에
이 논문에서
요약
초록
혈관신생은 기존 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 과정입니다. 새로운 혈관 성장은 관형 구조를 형성하기 위해 조정된 내피 세포 증식, 이동 및 정렬을 필요로 하며, 벽화 지지를 제공하고 혈관 성숙을 촉진하기 위해 주피 세포를 모집해야 합니다. 현재의 체외 세포 배양 접근법은 내피 세포와 주피 세포가 상호 작용하여 기능적 혈관을 생성하는 복잡한 생물학적 환경을 완전히 재현할 수 없습니다. 우리는 중증 복합 면역 결핍 돌연변이(SCID) 마우스를 사용하여 내피-주막 세포 상호 작용 및 기능적 혈관 형성을 연구하기 위해 생체 내 매트릭스 젤 플러그 분석의 새로운 응용 프로그램을 제시합니다. 간단히 말해서, 매트릭스 겔을 주피세포가 있거나 없는 내피 세포를 포함하는 용액과 혼합한 다음 마취된 SCID 마우스의 뒤쪽에 주입합니다. 14일 후, 조직학적 분석을 위해 매트릭스 겔 플러그를 제거, 고정 및 절편화합니다. 성숙한 혈관의 주위 세포 적용 범위(내강에 적혈구의 존재로 정의됨)의 길이, 수, 크기 및 범위는 상업적인 통계 플랫폼을 사용하여 실험 그룹 간에 정량화하고 비교할 수 있습니다. 혈관 신생 분석법으로 사용하는 것 외에도 이 매트릭스 겔 플러그 분석은 유전자 연구를 수행하고 약물 발견을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜을 통해 연구자들은 내피-주피세포 상호 작용 및 전신 또는 폐 혈관 신생과의 관련성 연구를 위해 사용 가능한 체외 분석을 보완할 수 있습니다.
서론
혈관 신생은 새로운 혈관이 정상 개발 관련 질병에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 지속적인 연구의 초점을 기존의 혈관 망 (1)로 형성하고있다하는 과정이다. 이 역동적 인 과정은 증식과 혈관 내피 세포되는 EC () 및 산소와 영양 공급이 필요합니다 사이트 향하는 혈관 튜브를 구성하는 혈관 주위 세포의 모집의 이동을 포함한다. 이 프로세스는 동일 동적 분석, 관 형성의 3 차원 성질 요점을 되풀이 할 가장 중요한 하나가 필요보고자. 시험관 차원 매트릭스 분석이 요구를 충족하기 위해 개발되어 연구자 혈관 제자리 3, 4, 5, 6 소요되는 시간과 공간에서의 개별 단계를 정의 할 수 있도록 잘 작동 하였다. 그러나, 이러한 시험 관내 3D 행렬 모델은 비 혈관 관류 공부에 한정D 따라서 혈관 신생 과정과 관련된 중요한 구성 요소 부족 (예를 들어, 혈관 침대에서 성장 및 저해 요인, 자연스러운 긴장 / 힘을 순환) 라이브 조직에 존재하는 복잡한 환경을 시뮬레이션하는 데 실패합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여러 가지의 생체 내 혈관 신생 어 세이가 우리 ....
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프로토콜
윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 의학의 스탠포드 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
주 : 동물은 3 % 이소 플루 란 기화기와 O 2 가스의 3 % 공급 마취하에. 눈에 수의사 연고의 사용은 마취 상태에서 건조를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
1. 셀 준비
- 적절한 용지의 10 ml의 100mm 판에 인간의 내피 세포와 혈관 주위 세포 문화를 성장. 세포까지 삼일 80 % 포화 상태에 도달 - 매 2는 새로운 배지 10 ㎖를 교체합니다.
- 회사 보충 완전한 내피 세포 배지 (ECM)에서 배양 된 혈관 내피 세포 (EC에)는 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 %의 내피 세포 성장 보충 공급된다.
- 회사 전체 주연 세포 보충 미디어 (PM)에서 배양 혈관 주위 세포는 2 % FBS, 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % 주연 세포 성장 보충 공급된다.
- 세포 혼합물을 준비
- 실험 및 제어 그룹에 대한 세포의 필요한 수를 계산합니다.
참고 : 실험 그룹의 각 플러그는 백만 (× 10 6 1) 인간되는 EC 및 이십....
- 실험 및 제어 그룹에 대한 세포의 필요한 수를 계산합니다.
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결과
매트릭스 겔 플러그 부분의 대표 H & E 및 면역 염색은 플러그가 대부분 포함 플러그 반면 혈액 (왼쪽 그림 2 위에, 검은 색 화살표)를 관류되지 않는 일부 선박되는 EC 및 혈관 주위 세포가 모두 관류 여러 표시를 표시 EC에서 그림 2. 섹션을 표시됩니다 CD31 양성되는 EC 바로 옆에 긍정적 인 SMA 염색에 의해 입증 직경이 크고 완전한 주연 세포의 범위와 선박. 이러한 결과는 혈관 주위 세포는 신생 혈관 형성이 역동적 인 과정이 효과적으로 요약 쉽게 생체 내 모델에서 분석 될 수있는 중요한 역할을한다는 것을 제안한다.
조직 카세트.......
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토론
매트릭스 겔 플러그 분석은 혈관 신생, 혈관 신생 및 생체 내 혈관 형성 화합물의 유전자 조절을 평가하기 위해 시험 관내 테스트를 보완하기 위해 더욱 강력한 방법으로 입증되었다. 여기서는 상세히 용기 형성시 내피 세포와 주연 세포 간의 상호 작용을 조사 인간 혈관의 신규 매트릭스 겔 플러그 어 세이를 기술한다.
이 프로토콜에 몇 가지 새롭고 중요한 단계가 있습니다. 낮은 통로 (통로 1-4)에서 세포를 젊은 세포가 14 일 실험 설정에서 더 생존 할 수 있기 때문에 바람직하다. 사용하는 내피 세포의 개수는 최소 백만이며 주연 세포에 대한 EC의 비율은 5 : 1; 그러나, 증가 된 혈관 주위 세포 수는 모세 혈관에서의 커버리지를 향상시킬 것이다. 단독 내피 세포 실험군의 경우, 주입 된 세포의 총 수는 120 만 인 내피 세포 및 혈관 주위 세포의 합, 그에되어야E는 플러그 당 총 세포 수는 일치한다. 세포 수 및 겔 매트릭스 부피의 적절한 양.......
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공개 사항
경쟁하는 금전적 이해관계가 동봉되지 않습니다.
감사의 글
K. Yuan 박사는 미국심장협회 과학자 개발 보조금(15SDG25710448)과 폐고혈압협회 개념 증명상(SPO121940)의 지원을 받았습니다.V. de 예수 Perez 박사는 Robert Wood Johnson Foundation의 경력 개발상, NIH K08 HL105884-01 상, 폐고혈압 협회상, 미국 폐 협회의 생물의학 연구상, 중개 연구 및 응용 의학의 지원을 받았습니다 스탠포드 대학에서 상을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PBS(인산염 완충 식염수) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% 트립신/0.53mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| 내피 세포 배지(ECM) 키트 | Sciencell | 1001 | 에는 배지, EC 성장 보조제 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함되어 있으며, 각각 쉽게 혼합할 수 있도록 적절한 용량으로 공급됩니다 |
| Pericyte Media(PM) 키트 | Sciencell | 1201 | 배지, pericyte 성장 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하며, 각각은 |
| 1차 인간 폐 미세혈관 내피 세포 | 고혈압 돌파구 이니셔티브 | 이 세포 유형은 상업적으로도 이용 가능합니다. 통로 1-4에서 사용되는 세포 1-4 | |
| 일차 인간 폐 pericytes | 폐 고혈압 돌파 이니셔티브 | 이 세포 유형은 상업적으로 이용 가능하지 않지만 뇌 paricytes는 이용 가능합니다. 통로 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | 원액은 50 μ PBS에서 0.1% BSA의 g/ml, 50 &mu에서 부분 표본; l -20도에서 보관 |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin 주사기 | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) 마우스 | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD. SCID IL2R 감마 녹아웃 변형이 가장 좋은 변형입니다. 생후 4-6주 |
| 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균 | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15ml 나사 상형 튜브, 멸균 | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP 펜 | Life Technologies | 8899 | |
| 혈구계 | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair 제모 크림 | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell 시그널링 | 8961S | |
| 현미경 슬라이드 | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 커버 슬립 | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| 구연산염 완충액 10x | Millipore | 21545 | |
| 초미세 수술용 가위 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 포르말린(파라포름알데히드) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| 티슈 카세트 | Simport | M492-12 | |
| 염소 혈청 | Dako | X0907 |
참고문헌
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E.
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재인쇄 및 허가
