Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında
Summary
Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.
Abstract
Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.
Introduction
Anjiyogenez yeni kan damarları normal gelişim hastalığın kadar birçok alanda genelinde devam eden araştırma odağı önceden varolan damar ağı 1'den oluşan ve bir olan süreçtir. Bu dinamik süreç çoğalmasını ve endotel hücreleri (EC) ve oksijen ve besin teslim 2 ihtiyacı sitede yöneliktir vasküler tüp oluşturmak için perisitlerin işe göç içerir. Bu işlem, aynı derecede dinamik bir tahlil, tüp oluşumu üç boyutlu yapısını özetlemek için en önemlisi bir gerektirir incelenmesi. In vitro 3D matris deneyleri bu ihtiyaca cevap vermek geliştirilmiştir ve araştırmacılar anjiyogenez yeri 3, 4, 5, 6 aldığı uzay ve zamanda ayrık adımları tanımlamak için izin de çalıştı. Bununla birlikte, bu in vitro olarak 3D matris modelleri perfüze olmayan damarları, bir eğitim sınırlıdırd nedenle anjiyogenez sürecine uygun kritik bileşenleri eksikliği (örneğin, damar yatak boyunca büyüme ve inhibitör faktörler, doğal olmayan gerginlik / kuvvetleri dolaşan) ve canlı dokuda mevcut karmaşık ortamında simüle etmek için başarısız. Bu sınırlama gidermek için, birçok in vivo anjiyogenez deneyleri raporumuzun 8, 9 odak noktası olacaktır matris jel fiş deneyi de dahil olmak üzere, 7 geliştirilmiştir.
Matris jel fiş tahlil angiogeneziste farklı hücre ve maddelerin rolleri test etmek için sağlam bir platform sağlar olarak araştırmacılara hitap köklü in vivo anjiyogenez testtir. Matris jel 37 ° C 'de, bir jel-benzeri malzeme içine katılaşmaktadır Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücre çizgisi tarafından salgılanan bir ticari olarak temin edilebilir bazal membran çözümdür. Matris jel, büyüme faktörleri ve enjeksiyonundan gibi hücreler ve / veya maddeler ile karıştırılabilirfare içine deri altından cted. ev sahibi EC, 14 gün boyunca fişi işgal vasküler ağ oluşturacak ve konağın kanla perfüze hale gelecektir. Bugüne kadar, matris jel fiş deneyleri bu deney için ortak kültür endotel hücreleri ve perisitleri kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için hiçbir çaba henüz yapılmamıştır, bizim bildiğimiz kadarıyla, ancak, anjiyogenez sırasında endotel hücre davranış çalışma odaklanmış olması bu iki hücre tipleri anjiyogenez sırasında nasıl etkileşimde çalışmak için. Özellikle, EC ve perisitlere arasındaki ilişkiyi anlamak mikrovasküler iskemi ve periferik vasküler hastalık 10, 11, 12 de dahil olmak üzere kan damarı kaybı patolojik olan hastalıkların, eğitim için değerlidir.
Burada, insan EC ve fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile birlikte matris jel karışımına insandan türetilmiş perisitler getiren bir protokol açıklar. Bu karışım daha sonra deri altına enjekte edilebilirn, SCID farelerinin sırtı tam olarak işlevsel, perisit kaplanmış, hibrid damarlarının oluşumunu sağlamak için. Bizim protokol ile veya SCID fareleri ve nasıl kritik anjiyogenez bitiş noktaları için histolojik bölümleri analiz etmek, insan perisitlere, yerleştirme olmadan ya insan ECS içeren matris jel fişlerini hazırlamak açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matris jel yatağından tahlili, angiogenesisin, in vivo olarak anjiyogenik ve anti-anjiyojenik bileşikler gen regülasyonu değerlendirmek ve in vitro testler tamamlamak için kullanışlı ve güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Burada detaylı olarak damar oluşumu sırasında endotel hücrelerin ve perisitlerin arasındaki etkileşimi inceler insan anjiojenleri yeni bir matris jel yatağından tahlili tarif eder.
Bu protokolde birkaç roman ve kritik adıml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.
Materials
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28G 1cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5mL microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. . Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
