Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.
Den dama embryo gir en ypperlig virveldyr modell som kan brukes til å dissekere utviklings spørsmål på en direkte måte. Sin tilgjengelighet og robusthet etter kirurgisk inngrep er viktige eksperimentelle styrker. Glimmer platene var de første barrierene brukes for å hindre chick lem knopp innvielse en. Protokoller som bruker aluminiumsfolie som en ugjennomtrengelig barriere mot vinge knopp eller ben knopp induksjon og eller initiering er beskrevet. Vi kombinerer denne teknikken med perle plassering sideveis til hinder for eksogent forsyning kandidat endogene faktorer som har blitt blokkert av barrieren. Resultatene er analysert ved hjelp av in situ hybridisering av etterfølgende genekspresjon. Vårt hovedfokus er på rollen retinsyre signalering i induksjon og senere oppstart av kylling embryo forgrunnen og bakben. Vi bruker BMS 493 (en invers agonist av retinsyrereseptorer (RAR)) bløtlagt perler implantert i sideplaten mesoderm (LPM) for å etterligne virkningen av en tverrrier plasseres mellom somites (en kilde for retinsyre (RA)) og nevnte LPM fra hvilken lem knopper vokse. Modifiserte versjoner av disse protokollene kan også brukes til å ta opp andre spørsmål om opprinnelsen og timing av induktive signaler. Forutsatt at regionen av kylling embryo er tilgjengelig på den aktuelle utviklingsstadiet, kan en barriere anbringes mellom de to vev og påfølgende endringer i utvikling studert. Eksempler kan finnes i utviklingen av hjernen, akse forlengelse og i organutvikling, slik som lever eller nyre induksjon.
Klassiske embryologists tradisjonelt benyttet fysiske teknikker for å avhøre de mekanismene som styrer embryonal utvikling. I 1960 og 1970 etterforskere utviklet teknikker som brukes ugjennomtrengelige barrierer satt inn mellom vev i utvikling av embryo for å demonstrere viktigheten av induktive signaler under embryogenese. Vår interesse er i virveldyr lem utvikling og spesielt hvilke hendelser forut lem knopp utvekst. For eksempel kan innføring av en barriere for å hindre lem knopp utvekst oppstår på den ene side av kylling embryo samtidig som det å fortsette normalt på den kontralaterale, unoperated side. Materialer som brukes for å lage disse barrierene variert; for eksempel, glimmer platene 1 og tantal folie 2. Disse barrierene effektivt skille sideplaten mesoderm (LPM), hvorfra lem bud former, fra de somites dannet fra paraksialt mesoderm. Kirurgiske pode teknikker viser at nær tilknytning viddh somites er viktig hvis lem knopp oppstart skal skje i LPM 3 4. På 80-tallet og 90-tallet utviklings biologer oppdaget diffusible signalmolekyler som er avgjørende i å kontrollere utviklingsprosesser. Perler fuktet med disse signalmolekyler kan implanteres i spesifikke områder av embryoet og produsere endringer i embryonal utvikling. For eksempel er retinsyre (RA) som opptas av ionebytterperler frigis over en 24-timers periode når implantert i en kyllingembryo og kan produsere speilbilde duplisering av sifrene 5. Heparin akryl perler inneholder FGF protein kan initiere lem bud utvekst fra interlimb LPM 6.
Mer nylig mus og fiske genetikk har tatt studiet av virveldyr lem innvielse i en ny epoke (anmeldt i 7). Det er god dokumentasjon på at RA tilstede i somites før lem knopp initiering er den avgjørende diffusible signal kreves av LPM å initiere lem spirende. Vi ønsket å utnytte tilgjengelighet og eksperimentell robusthet av kylling embryo å dissekere effekten av barriere implantasjon på genuttrykk i LPM rundt tidspunktet for lem bud innvielse. En roman tilpasning av vår metode er å kombinere en barriere som blokkerer signalene fra aksiale vev med perle plassering sideveis til hinder for eksogent forsyning kandidat endogene faktorer som har blitt blokkert av barrieren. Følgende protokoller er de som er utviklet for å erte ut mekanismene for lem bud induksjon og innvielse.
Studerer lem knopp innvielse betyr å bruke tidlig stadium embryoer. Mange forskere vindu kyllingegg ved først å fjerne noe av albumin gjennom luftsekken med en hypodermisk nål. Embryo, som ligger på toppen av eggeplomme, vil da ligge lavere i egget. Dette er en fordel for noen teknikker, som for eksempel elektroporering, men kan være en ulempe hvis kirurgisk manipulering av embryoet er ønsket.Vi synes å ha embryoet så nær åpningen i egget som mulig, er en fordel.
Spørsmål gjenstår om de signalene som styrer virveldyr lem knopp induksjon og initiering og følgende protokoller er egnet til å løse dem. Vi er de første til å utvikle en protokoll for innsetting av barrierer for å hindre at dama lem knopp utvekst på et stadium før scenen 12 8. Modifiserte versjoner av disse protokollene kan også brukes til å ta opp andre spørsmål om opprinnelsen og timingen av induktive signaler hvor en rullestol induserende vev ligger ved siden av primordium blir indusert. Forutsatt regionen av embryoet er tilgjengelig på den aktuelle utviklingsstadiet, da en barriere kan plasseres mellom de to vev og påfølgende endringer i utvikling studert. Eksempler kan finnes i hjernens utvikling, akse forlengelse og eventuelt organutvikling slik som lever eller nyre induksjon.
Vi beskriver bruk av ugjennomtrengelige barrierer for å hindre lem knopp formasjon i kylling embryo. Denne teknikk har en rekke kritiske trinn. Etter preliminære forsøk har vi funnet at hengformede barrierer som brukes i 9, 10 forblir på plass i embryoet langt bedre enn rette barrierer. Den distale flate siden av barrieren fester seg til vitelline membranen og holder barrieren på plass (figur 2C). Grundige forberedelser av hengslene formet barrierer fra aluminiumsfolie som beskrevet i protokollen steg 1,6 er avgjørende for å lykkes med operasjonen. Et annet viktig skritt er å sikre at eggene ikke er utelatt fra inkubator for lenge etter vindus og iscenesettelse før bruk på fosteret. I vår erfaring, embryoer overleve en operasjon bedre hvis de er på eller i nærheten av rugetemperatur når operasjonen er utført. Operasjoner bør derfor utføres så raskt som mulig, og eggene resealed raskly for å sikre god overlevelse. Mange forskere legge en dråpe av antibiotika til embryoet følgende mikro før retur egg til inkubatoren. Tilstedeværelsen av væsken hindres bommene fra å holde godt på plass. Tilsetting av antibiotika kan også løsne perler etter plassering. Derfor bruker ikke antibiotika, raske drift og god renslighet med instrumenter er anbefalt for å unngå smitte. Tørke instrumenter med 70% etanol etter hver fase av en operasjon er avgjørende for å hindre instrumenter fra å bli klissete fra kontakt med vitelline membran som kan føre til både barrierer eller perler til å følge tang (se protokoll trinn 3.1.2.2). Begge varianter av perler som brukes kan falle ut av plass etter operasjonen. Når barriereposisjonen ble kontrollert den neste dag var det ikke mulig å se gjennom barrieren for å fastslå om vulsten holdt seg på plass eller ikke. I tilfeller der kulen hadde falt ut vingen knopp utvekst ikke ble reddet ( <strong> Tabell 1). Unngå overføring væske med perle når implantere dem betyr at perler stokk lettere å kuttet ansiktet av LPM (se protokoll 2.3.2.3). Endelig sikre at embryoer blir løst umiddelbart etter høsting er avgjørende for god påfølgende analyse av genuttrykk (se protokoll trinn 4.2).
Denne protokollen endrer tidligere publiserte eksperimenter som brukes barrierer for å hindre lem knopp initiering, definerer spesifikke optimale bredder for barrierer og introduserer kombinere barriere og perle emisjon etterfulgt av analyse av genuttrykk. Vi har funnet ved hjelp av konvensjonelle aluminiumfolie, som er billig og lett tilgjengelig i alle laboratorier, frembringer resultater som er lik de som tidligere er brukt tantal folie. Folien kan stå i embryoet ved gjennomføring av in situ hybridisering (figur 2C '), men vi fjerner vanligvis det hvis mer enn en embryo blir behandlet for å hindre at de skarpe kantene på folien å skade embryoer. PIlot studier viste at bredden av benet region barrierer er spesielt viktig. Utgangspunktet barrierene praksis var for kort og ben bud utvekst ble ikke hindret. 1,2-1,3 mm er den optimale bredde for en barriere for å blokkere ben knopp utvekst helt. Den smaleste vinge barrierer som man kan plassere nøyaktig for å hindre knopp utvekst gi de beste overlevelse. Dette kan være så smale som 0,5-0,7 mm. Men barrierer som er litt bredere er mer sannsynlig å resultere i fullstendig blokkering av vingen bud utvekst fordi de gir mulighet for en liten unøyaktighet av emisjonen (vi brukte 0,7-1 mm). Unngåelse av blodkar når du gjør snittet er kritisk for vingen knopp nivå barrierer. Semi-permeable barrierer har tidligere blitt brukt til å halvere dama lem knopp. MacCabe og Parker, 1976 og Summer, 1979 både brukte filtre 0,45 um og 0,8 um porestørrelse, henholdsvis 16, 17. De rapporterte at diffusible signaler kan passere gjennom porene i filtrene, og atResultatene oppnådd ved hjelp av semi-permeable barrierer var midt mellom en lem bud med ingen hindring til stede og en med en ugjennomtrengelig tantal folie barriere. Denne protokollen kan tilpasses for å bruke semipermeable barrierer av varierende porestørrelse for å skille kandidatsignaler basert på størrelse eller for å modifisere dynamikken i signal diffusjon.
Denne protokollen har forskjellige begrensninger i hovedsak knyttet til modellorganisme selv. Slike teknikker kan brukes til å undersøke ytterligere spørsmål i lem utvikling og også andre spørsmål av virveldyr embryogenese. En forutsetning er at orgelet / aktuelle området bør utvikle når kylling embryo er tilgjengelig for intervensjon. Tilstedeværelsen av store blodkar i området hvor en barriere må plasseres gjør barriere plassering senere stadium enn 13 eller 14 teknisk utfordrende. Hvis store blodkar er kuttet under barriere plassering kan dette føre til embryo dødelighet. Vår undersøkelse av når transkripsjonsfaktorer TBX5 og Tbx4 først indusert i LPM var begrenset av den tidligste stadiet hvor vi kan plassere en barriere som senere skulle ende opp med motsatt enten vingen eller ben knopp hhv. Det kan være opplysende å forsøke å blokkere TBX genet induksjon på tidligere stadier, nærmere gastrulation. Den tidligste en barriere kan være plassert i den presumptive vingen region med hell var trinn 8 og i benet region trinnet 10. Denne protokollen er sannsynligvis ikke egnet for studier av genekspresjon utover lem knopp trinn fordi påfølgende rask vekst vil forskyve barrieren og resultatene ville forholde seg bare til utgangsstillingen av barrieren.
Etter å ha relaterte begrensninger av kylling embryo i denne sammenheng, dets fordeler fremfor andre virveldyr modellorganismer er mange. Den kyllingembryo er en meget egnet dyremodell for denne type av fysisk inngrep i et virveldyr embryo. Embryoene er relativt store og er lett tilgjengelig igjennomgh eggeskallet. Man kan gå tilbake til embryo for videre eksperimentering (for eksempel fjerning av en perle 18 eller enda en barriere) eller for å sjekke fremdriften ved å fjerne tapen vinduet. Det er mulig omfang til å inkludere levende avbildning eller tid lapse imaging. Vi beskriver en metode for vindus kylling egg som er spesielt egnet til å operere på tidlig stadium embryoer. I tilfelle av ekstremitets studier er det svært viktig og nyttig at det er en kontralateral kontroll lem for hvert eksperiment som fungerer som en ideell intern kontroll for hver biologisk replikere.
Kombinasjonen av å bruke ugjennomtrengelige barrierer for å hindre lem utvekst og perler dynket i signalmolekyler har ikke blitt rapportert før. Vår analyse av mRNA uttrykket etter slike inngrep er også romanen. Disse teknikkene gjort oss i stand til å dissekere den vanskelige problemet med når lem spesifikke transkripsjonsfaktorer Tbx5 og Tbx4 blir indusert i LPM og ogsåfor å vise at senere, før lem knopp initiering, er tilstedeværelsen av disse TBX gener i LPM ikke er tilstrekkelig for aktivering av Fgf10 transkripsjon og starten av lem knopp utvekst. Figurene 2G, 2D og 2E illustrerer disse funnene også. Fraværet av Tbx4 uttrykket etter innsettingen av en barriere ved trinn 10 på figur 2G er i sterk kontrast til dens tilstedeværelse i 2D og 2E følgende barriere innsetting i trinn 15, etter induksjon av Tbx4. Implantasjon av RA gjennomvåt perler tilrettelagt redning av lem bud initiering følgende barriere innsetting og så peker på RA fra somites være avgjørende i LPM før lem knopp utvekst kan begynne. Slike teknikker kan brukes til å løse flere spørsmål i lem utvikling, men også andre spørsmål av virveldyr embryogenese. Områder i hjernen, øyet og stammen er sannsynlig å være egnet.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.
Dumont No.5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
Dumont No.4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
Blunt ended curved forceps, | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
ends approx 0.5 cm long | |||
Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
Mineral oil | |||
Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500ml |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500ml |
Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |