Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.
Kycklingembryo ger en superb ryggradsdjur modell som kan användas för att dissekera utvecklingsmässiga frågor på ett direkt sätt. Dess tillgänglighet och robusthet efter kirurgiskt ingrepp är viktiga experimentella styrkor. Mica plattorna var de första hindren som används för att förhindra chick lem knopp initiering 1. Protokoll som använder aluminiumfolie som en ogenomtränglig barriär mot ving knopp eller ben knopp induktion och eller initiering beskrivs. Vi kombinerar denna teknik med pärla placering i sidled till hinder för exogen tillförsel kandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Resultaten analyseras med användning av in situ-hybridisering av efterföljande genexpression. Vårt huvudsakliga fokus ligger på sig rollen av retinsyra signalering i induktion och senare initiering av kycklingembryo förgrunden och bakbenen. Vi använder BMS 493 (en invers agonist av retinsyrareceptorer (RAR)) bomullstrasa pärlor implanterade i den laterala plattan mesoderm (LPM) för att efterlikna effekten av en bartransportören placeras mellan somites (en källa av retinsyra (RA)) och LPM som lem knoppar växa. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler. Förutsatt den region i kycklingembryo är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, kan en barriär placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan återfinnas i den växande hjärnan, axel förlängning och organutveckling, såsom lever eller njure induktion.
Klassiska embryologer traditionellt användes fysiska tekniker för att förhöra de mekanismer som styr embryoutveckling. Under 1960- och 1970-talet utvecklade utredare tekniker som används ogenomträngliga barriärer insatta mellan vävnader i det utvecklande embryot att visa betydelsen av induktiva signaler under embryogenes. Vårt intresse är i ryggradsdjur lem utveckling och i synnerhet vilka händelser före lem knopp utväxt. Till exempel kan insättningen av en barriär förhindrar extremitetsanlag utväxt från att uppstå på en sida av kycklingembryo och tillåta det att fortsätta normalt på den kontra, oanvänd sida. Material som används för att göra dessa hinder varierad; exempelvis glimmerplattor 1 och tantal folie 2. Dessa hinder effektivt separera sidoplåten mesoderm (LPM), från vilken lem knopp former, från somites bildas från det paraxiella mesoderm. Kirurgiska ympning tekniker visar att nära samarbete with somites är en förutsättning för att lem knopp initiering skall ske i LPM 3 4. På 80-talet och 90-talet upptäckte utvecklingsbiologer diffunderbara signalmolekyler som är nödvändiga för att kontrollera utvecklingsprocesser. Pärlor indränkt med dessa signalmolekyler kan implanteras i specifika regioner i embryot och producera ändringar i embryonal utveckling. Till exempel är retinsyra (RA) tas upp av jonbytarmaterial pärlor frisätts över en 24-timmarsperiod när de implanteras in i en kycklingembryo och kan producera spegelbild dubblering av siffrorna 5. Heparin akrylpärlor innehållande FGF protein kan initiera lem knopp utväxt från interlimb LPM 6.
På senare tid har mus och fisk genetik har tagit studien av ryggradsdjur lem inledande in i en ny era (översikt i 7). Det finns goda bevis för att RA förekommer i somites före lem knopp initiering är det väsentliga diffunderbart signal som krävs av LPM att initiera lem spirande. Vi ville utnyttja tillgängligheten och experimentell robusthet kycklingembryo att dissekera effekten av barriär implantation på genuttryck i LPM runt tiden för lem knopp inledande. En ny anpassning av vår metod är att kombinera ett hinder som blockerar signalerna från axiella vävnader med pärla placering i sidled till hinder för exogent försörjningskandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Följande protokoll är de som utvecklats för att locka fram de mekanismer för lem knopp induktion och initiering.
Studera lem knopp initiering innebär att använda embryon tidigt stadium. Många forskare fönster hönsägg genom att först ta bort en del av albumin genom luftsäcken med en injektionsnål. Embryot, som ligger på toppen av äggulan, därefter kommer att ligga lägre i ägget. Detta är en fördel för vissa tekniker, såsom elektroporation, men kan vara en nackdel om kirurgisk manipulation av embryot önskas.Vi finner att ha embryot så nära öppningen i ägget som möjligt är en fördel.
Frågor kvarstår om de signaler som styr ryggradsdjur lem knopp induktion och initiering och följande protokoll är lämpliga för att ta itu med dem. Vi är de första att utveckla ett protokoll för införande av barriärer för att förhindra chick lem knopp utväxt på ett stadium tidigare än steget 12 8. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler där en tillgänglig inducerande vävnad ligger intill primordium induceras. Förutsatt regionen av embryot är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, då en barriär skulle kunna placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan hittas i hjärnans utveckling, axel förlängning och eventuellt organutveckling såsom lever eller njure induktion.
Vi beskriver användningen av ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem knopp bildning i kycklingembryo. Denna teknik har ett antal kritiska steg. Efter preliminära experiment, fann vi att gångjärnsformade barriärer som används i 9, 10 kvar i embryot mycket bättre än raka hinder. Den distala flata sidan av barriären fastnar på vitellinmembranet och håller barriären på plats (figur 2C). Noggranna förberedelser av gångjärns formade hinder från aluminiumfolie som beskrivs i protokoll steg 1,6 är avgörande för framgången av verksamheten. En annan viktig steg är att se till att äggen inte lämnas ut ur inkubatorn för länge efter fönster och iscensättning före drift på embryot. I vår erfarenhet, embryon överlever en operation bättre om de är vid eller i närheten av inkubationstemperatur när operationen utförs. Verksamheten bör därför genomföras så snabbt som möjligt och äggen återförslutas promptly att säkerställa goda överlevnad. Många forskare lägger en droppe av antibiotika för att embryot efter mikro innan han återvände äggen till inkubatorn. Närvaron av vätskan förhindras barriärerna från att fastna väl i läge. Tillsats av antibiotika kan också rubba pärlor efter placering. Därför inte använder antibiotika, snabba operationer och god renhet med instrument rekommenderas för att undvika infektion. Torka instrument med 70% etanol efter varje steg i en operation är nödvändig för att förhindra instrument blir klibbigt kontakt med vitellinmembranet som kan orsaka både hinder eller pärlor att följa pincett (se protokoll steg 3.1.2.2). Båda sorter av pärlor som används kan falla på sin plats efter operationen. När barriär läge kontrollerades nästa dag var det inte möjligt att se igenom barriären att avgöra om kulan kvar på plats eller inte. I de fall där vulsten hade fallit ut ving knopp utväxt inte räddades ( <stRong> Tabell 1). Undvika överföring av vätska med pärlan när implanterar dem innebär att kulorna fastnar lättare på den avskurna ytan av LPM (se protokoll 2.3.2.3). Slutligen se till att embryon fixeras omedelbart efter skörden är avgörande för god efterföljande genexpressionsanalys (se protokoll steg 4,2).
Detta protokoll modifierar tidigare publicerade experiment som använde barriärer för att förhindra lem knopp initiering definierar specifika optimala bredder för hinder och introducerar kombinera barriär och pärla placering följt av genuttryck analys. Vi fann att använda konventionell aluminiumfolie, som är billig och lätt tillgänglig i alla labb, producerar resultat likvärdiga med dem som tidigare använt tantal folie. Folien kan vara kvar i embryot när de utför in situ hybridisering (figur 2C) men vi brukar ta bort det om mer än ett embryo bearbetas för att förhindra att skarpa kanter på folien skada embryon. PIlot studier visade att bredden av benet region hinder är särskilt viktigt. Initialt hindren trialed var alltför kort och ben knopp utväxt inte förhindras. 1,2-1,3 mm är den optimala bredden för en barriär för att blockera benet knopp utväxt helt. De smalaste ving hinder som man kan placera noggrant för att förhindra knopp utväxt ger bäst överlevnad. Det kan vara så smal som 0,5-0,7 mm. Men hindren som är lite bredare är mer sannolikt att resultera i fullständig blockering av ving knopp utväxt eftersom de möjliggör en liten felaktighet av placering (vi använde 0,7-1 mm). Undvikande av blodkärl när du gör snittet är avgörande för ving knopp nivå hinder. Semipermeabla barriärer har tidigare använts för att halvera ungen lem knopp. MacCabe och Parker, 1976 och Summer, 1979 båda används filter 0,45 um och 0,8 um porstorlek, respektive 16, 17. De rapporterade att diffunderbara signaler kan passera genom porerna i filtren och attresultat fick hjälp av halvgenomträngliga hinder var halvvägs mellan en lem knopp utan hinder är närvarande och ett med en ogenomtränglig tantal foliebarriär. Detta protokoll skulle kunna anpassas för att använda semipermeabla barriärer med varierande porstorlek för att differentiera kandidatsignalerna baserade på storlek eller för att modifiera de dynamiken i signal diffusion.
Detta protokoll har olika begränsningar främst i samband med modellorganism själv. Sådana tekniker kan användas för att undersöka ytterligare frågor i lem utveckling och även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. En förutsättning är att organet / aktuella området bör utvecklas när kycklingembryo är tillgänglig för intervention. Närvaron av stora blodkärlen i området där en barriär måste placeras gör barriär placering senast steget 13 eller 14 tekniskt utmanande. Om stora blodkärl skärs under barriär placering kan detta leda till embryodödlighet. Vår undersökning av när transkriptionsfaktorer TBX5 och Tbx4 först induceras i LPM begränsades av den tidigaste skede då vi kan placera en barriär som senare skulle hamna mitt emot antingen vingen eller benet knopp respektive. Det skulle kunna belysa att försöka blockera TBX geninduktion i tidigare skeden, närmare gastrulation. Det tidigaste en barriär skulle kunna placeras i den presumtiva wing region med framgång var etapp 8 och i benområdet steget 10. Detta protokoll är förmodligen inte lämpar sig för studier av genuttryck bortom lem knopp stadier eftersom efterföljande snabb tillväxt skulle förskjuta barriären och resultat skulle endast avse den initiala positionen av barriären.
Efter att ha relaterade begränsningar i kycklingembryo i detta sammanhang, dess fördelar jämfört med andra ryggradsdjur modellorganismer är många. Kycklingembryo är en mycket lämplig djurmodell för denna typ av fysiskt ingrepp i ett ryggradsdjur embryo. Embryona är relativt stora och är lättillgängliga through äggskal. Man kan återvända till embryot för ytterligare experiment (t.ex. avlägsnande av en sträng 18 eller till och med en barriär) eller för att kontrollera om framstegen genom att helt enkelt ta bort tejpen fönstret. Det är möjligt att även omfatta levande avbildning eller tidsförlopp avbildning. Vi beskriver en metod för fönster hönsägg som är särskilt lämpade för drift på embryon tidigt stadium. I fallet med lem studier är det mycket viktigt och användbart att det finns en kontralaterala kontroll lem för varje experiment som fungerar som en idealisk intern kontroll för varje biologisk replikat.
Kombinationen av att använda ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem utväxt och pärlor indränkt i signalmolekyler har inte rapporterats tidigare. Vår analys av mRNA-uttryck efter sådana insatser är också ny. Dessa tekniker det möjligt för oss att dissekera det svåra problemet med när lem specifik transkriptionsfaktorer Tbx5 och Tbx4 induceras i LPM och ävenför att visa att senare, före lem knopp initiering, är närvaron av dessa TBX gener i LPM inte är tillräcklig för aktivering av Fgf10 transkription och starten av extremitetsanlag utväxt. Figurerna 2G, 2D och 2E visar dessa resultat väl. Frånvaron av Tbx4 uttryck efter införandet av en barriär vid steg 10 i figur 2G står i skarp kontrast till sin närvaro i 2D och 2E följande barriär insättning vid steg 15, efter induktion av Tbx4. Implantation av RA indränkt pärlor lättade räddnings lem knopp initiering efter barriär insättning och så pekar RA från somites vara viktigt i LPM innan lem knopp utväxt kan börja. Sådana tekniker kan användas för att lösa frågor i lem utveckling men även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. Områden i hjärnan, ögat och stammen kommer sannolikt att vara lämpliga.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.
Dumont No.5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
Dumont No.4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
Blunt ended curved forceps, | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
ends approx 0.5 cm long | |||
Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
Mineral oil | |||
Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500ml |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500ml |
Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |