Summary

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת<em> Nematostella vectensis</em

Published: January 14, 2017
doi:

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

צורבים, ובאופן ספציפי הידרה, היו הבעלים החיים הראשונים הראו להתחדש מבנים שניזוקו או נקטעים, ואכן מחקרים כאלה לטעון השיקו חקירה ביולוגית מודרנית דרך העבודה של Trembley לפני יותר 250 שנה. נכון להיום המחקר של התחדשות חלה התעוררות מחודשת הן באמצעות "קלאסיים" אורגניזמים רגנרטיבית, כגון הידרה, planaria ו Urodeles, כמו גם קשת הרחבת מינים פורש טווח של metazoa, מן ספוגים באמצעות יונקים. מלבד העניין המהותי שלה כתופעה ביולוגית, הבנה כיצד התחדשות עובדת במגוון מינים תרצינה להודיע ​​לנו על האם תהליכי התחדשות לשתף תכונות משותפות ו / או מינים או בהקשר ספציפי מנגנונים תאיים ומולקולריים. כלנית הים כוכבנית, vectensis Nematostella, הוא אורגניזם מודל המתעוררים להתחדשות. כמו ההידרה, Nematostella הוא חבר של המערכה העתיקה, הצורבים, אבל בתוך tהוא בכיתה anthozoa, clade אחותו אל הידרתים כי הוא אבולוציונית יותר הבסיס. לכן היבטים של התחדשות Nematostella יהיו מעניינים להשוות לעומת עם אלה של ההידרה צורב אחרים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה לחצות, להתבונן ולסווג התחדשות של סוף aboral של המבוגר Nematostella, אשר נקרא physa. Physa עובר ביקוע טבעי כאמצעי רבייה מינית, ואו ביקוע טבעי או קטיעה ידנית של physa מפעילה מחדש צמיחה הרפורמציה של מורפולוגיות מורכבות. כאן יש לנו קודיפיקציה שינויים מורפולוגיים פשוטים אלה בתוך מערכת Staging התחדשות Nematostella (להלן NRSS). אנו משתמשים NRSS כדי לבחון את ההשפעה של chloroquine, מעכב פונקציה ליזוזומלית שחוסמת autophagy. התוצאות מראות כי התחדשות של מבנים פוליפ, ובמיוחד mesenteries, הוא לא נורמלי כאשר autophagy מעוכבת.

Introduction

התצפית של התחדשות ב הידרה יחיד הייתה האירוע המכונן כניסתו של ביולוגיה כמו 1,2 מדע ניסויי. ההתחדשות נשארת תופעה של משיכה רחבה באופן יוצא דופן כדי ביולוג ולהניח אדם כאחד. פוטנציאל ביולוגים התפתחותיים, קלינאים, מדענים ביו מהנדסים רקמות להבין ולהתגבר על המגבלות על התחדשות אדם עושה ביולוגית התחדשות יותר מעניין מהותי.

עכשיו, עם השימוש של טכנולוגיות מתפתחות כגון הגנום רצף רווח והפסד של כלי פונקציה, השדה צפוי ניסה להפריד מנגנון שיקום וכדי בסופו של דבר להבין כיצד שונה מינים יכול להתחדש בעוד שאחרים לא יכולים. מידת האחידות בתגובות מולקולריות, תאית מורפולוגיים נותרה הובהרה, אך עד כה נראה כי התגובות הבסיסיות בקרב בעלי חיים שיכולים להתחדש דומות יותר מאשר יצטרך Imagi היהנד רק לפני עשור 3.

צורב בפרט הם קלילים על התחדשות כמעט כל חלקי גופם בתוך קשת רחבה של גיוון מורפולוגיים. מתוך פוליפ מים הבודד הטרי, הדרתי יחד עם הפוליפים הימיים הזעירים לבנות שוניות אלמוגים עצומות, אל בסיפונופורים הקולוניאלי המורכב, כגון Man-O-המלחמה הפורטוגזית, התחדשות היא לעתים קרובות במצב של רבייה, בנוסף מנגנון תיקון או רפורמה חלקי גוף פגומים או אבד כתוצאה מפגיעה וטריפה. אם המינים השונים של צורבים להשתמש מנגנונים דומים או שונים להתחדשות היא שאלה מעניינת ביסודו 4-6.

אנחנו, ואחרים כבר בפיתוח anthozoan, Nematostella vectensis כמודל התחדשות 7-17. אנחנו לאחרונה פתחנו מערכת אחסון זמנית לתיאור התחדשות של גוף כולו מחתיכה אחידה מורפולוגית של רקמות נחצתה מן aboraסוף l של הפוליפ 10. בעוד פוליף Nematostella יכולים להתחדש כאשר נחצו ברמה כזו או אחרת, בחרנו לחתוך מבוגרים לעבר עמדת aboral באזור הפשוט ביותר מורפולוגית, את physa, בין שאר כי זה קרוב המטוס הרגיל של ביקוע מיני טבעי 18, וגם בגלל זה תצפית היתרים בניתוחים מולקולריים לאופן שבו גוף כולו מחדש מן הרכיבים מורפולוגיים הפשוטים.

מערכת staging התחדשות Nematostella (NRSS) מספקת מערכת פשוטה יחסי של מבחני ביצועים מורפולוגיים שיכול לשמש להבקיע את ההתקדמות של כל היבט של התחדשות ידי physa קטוע, בתנאי תרבות נורמלים או ניסיוני מוטרד מצבים כגון טיפולי מולקולה קטנים, מניפולציה גנטית , או שינוי סביבתי. כצפוי, NRSS הופכת אמצה כמו פיגום מורפולוגיים שעליו האירועים התאיים ומולקולריים של התחדשות יכולים להיות הופנה10.

לבסוף השיטה של חיתוך שלנו מייצרת הזמנות כמה חור שנפערו גודל גדול יותר לנקב סיכת נקודה בשימוש במחקר שנערך לאחרונה 17, עדיין הוא לרפא את הפצעים סביב 6 שעות. תיעוד השלב חזותי מעצר והמובחן של סגירת פצע צריכה להציע גישות ניסיוניות להסביר את העצמאות לכאורה של הגודל של פצע ואת הזמן שנדרש כדי לסגור. לפיכך, הבנה ויזואלית עמוקה יותר של תהליך קטיעת aboral, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, תסייע חקירות נוספות לתוך מערכת התחדשות המודל הזה ולהרחיב את היישום של מערכת קביעת שלב זו באמצעות Nematostella vectensis.

Protocol

מיזוג 1. של בעלי חיים עבור טמפרטורה, תזונה מחזור אור / חושך השג מבוגרי vectensis Nematostella מאחד מעבדות Nematostella הרבות ברחבי העולם, או ספק ללא כוונת רווח (לוח 1) לשמור Nematostella בטמפר…

Representative Results

ההתקדמות של אירועים מורפולוגיים במהלך רגנרציה ב physa הכרות מוצג באיור 1 א ', הכולל נופים נציג physa בכל שלב NRSS. האתר לחתוך physa הטיפוסי מותווה על המבוגר (ראשי החץ). הצילומים איור 1A להראות התחדשות מתקדמת של מבנים אוראלי הגוף מפני physa טרי ב…

Discussion

שימוש Nematostella כמודל של ריפוי פצעים והתחדשות אהיה יותר ויותר פופולרי. לכן, חשוב להיות מסוגל לדמיין את דפוסי מורפולוגיים של פרוטוקול מסוים לפני ניתוחים תאיים ומולקולריים יעילים ניתן להקצות והשווה. Nematostella יש רמה גבוהה של "גמישות" משובים, יכולת לבצע רפורמה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תאי גזע ניו יורק למדע (NYSTEM C028107) מענק GHT.

Materials

Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml Carolina Biological Supply 741004 250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml Carolina Biological Supply 741006 1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml  USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter Corning  3160 can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 – 40x magnification 

References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. . Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley’s Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).
  2. Trembley, A. . Mémoires pour servir à l’histoire d’un genre de polypes d’eau douce, à bras en forme de cornes. , (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?. Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?. Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science’s super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

View Video