スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導<em> Nematostella vectensis</em
Summary
Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Abstract
刺胞動物、具体的にHydraは 、損傷を受けたり、切断構造を再生するために示した第一の動物であった、そして実際にこのような研究は間違いなく250年以上前にトレンブレーの仕事を通じて、現代生物学的調査を開始しました。現在再生の研究では、両方の「クラシック」の再生などヒドラ 、プラナリアやUrodelesのような生物、ならびに海綿から哺乳動物を介して、後生動物の範囲を、スパニング種の拡大スペクトルを用いて復活を見ています。生物学的現象としての本質的な関心に加えて、再生は様々な種でどのように機能するかを理解することは、再生プロセスは、共通の特徴および/または種またはコンテキスト固有の細胞および分子メカニズムを共有しているかどうかをお知らせします。女優のイソギンチャク、Nematostella vectensisは 、再生のための新たなモデル生物です。 ヒドラのように、Nematostellaは古代の門、刺胞動物のメンバーですが、トン内彼のクラス花虫綱、進化的により基礎であるヒドロ虫の姉妹クレード。したがってNematostellaでの再生の側面は、比較し、 ヒドラ及びその他の刺胞動物のものと対比するために興味深いものになります。この記事では、我々は、二等分観察し、physaと呼ばれるNematostella大人の尾方端の再生を分類する方法を提示します。 physaは自然に無性生殖の手段として、核分裂を起こし、自然核分裂またはphysaの手動切断のいずれかは、複雑な形態の再成長と改革をトリガします。ここでは、Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）におけるこれらの単純な形態学的変化を成文化しています。私たちは、クロロキンの効果、リソソーム機能ブロックのオートファジーの阻害剤をテストするためにNRSSを使用しています。結果は、自食作用が阻害されたときにポリープ構造、特に腸間膜の再生が異常であることを示しています。
Introduction
単一ヒドラにおける再生の観察は、実験科学の1,2のような生物学の出現で精液のイベントでした。再生は、生物学者に非常に広くアピールの現象のままと同様に人を置きます。人間の再生の限界を理解し、克服する発生生物学者、臨床医、生物医学科学者や組織のエンジニアの可能性はより本質的に興味深いより再生生物学になります 。
さて、このようなゲノム配列決定およびゲインと機能ツールの損失などの新たな技術を使用して、フィールドが回生機構を離れていじめるために、最終的に他の人がすることはできませんが再生成することができますどのように様々な種を理解する態勢を整えています。 、分子細胞性および形態学的応答における共通の度合いはまだ解明されていないが、今のところ再生することができる動物の間の基本的な応答がimagiであったであろうよりも類似していると思われますNEDのみ一昔前3。
特に、刺胞動物は、形態的多様性の広いスペクトルの中で、ほぼすべての身体の部分のを再生するに容易です。孤独な淡水ポリープから、ハイドラは、ポルトガル人-O-戦争のような複雑な植民地siphonophoresに、広大なサンゴ礁を構築小さな海洋ポリープと共に、再生はのための機構に加えて、多くの場合、再生モードであり、怪我や捕食に起因する破損や紛失の体の部分を修理または改。刺胞動物門の多様な種が再生のために類似または異なるメカニズムを使用するかどうかを根本的に興味深い質問4-6です。
私たち、そして他の人が再生7-17のモデルとして花虫類、Nematostella vectensisを開発してきました。我々は最近、aboraから二分組織の形態学的に均一な片から体全体の再生を記述するためのステージングシステムを開発しましたポリープ10のリットルの終わり。任意のレベルで二分したときNematostellaポリープを再生成することができますが、我々はこれが自然な無性分裂18の通常の平面に近いため一部では、ほとんどの形態学的に単純な地域、physaで尾方の位置で大人をカットすることを選んだ、ともあるため体全体が最も単純な形態学的構成要素から組み立て直されているかを観察し、分子解析を可能にします。
Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）は、通常の培養条件下で、切断physaによって再生のいずれかの態様の進捗状況を採点するために使用することができる形態学的ベンチマークの比較的単純なセットを提供したり、実験的にそのような小分子治療、遺伝子操作などの状況を摂動しました、または環境の変化。予想通り、NRSSは再生の細胞および分子事象を参照することが可能な形態学的足場として採用されつつあります10。
最後に、切断の我々の方法は、最近の研究17で使用されるピンポイント穿刺よりも数桁大きいぽっかりと穴を生成し、まだ両方の傷は6時間の周りで癒します。創傷閉鎖の視覚的に逮捕した別個のフェーズを文書化することは傷の大きさと、それを閉じるのにかかる時間の見かけ上の独立性を説明するために実験的アプローチを示唆している必要があります。したがって、このプロトコルによって提供される尾方切断プロセスのより深い視覚的理解は、このモデル再生システムにさらなる研究を支援し、Nematostella vectensisのを使用して、この病期分類システムの適用を拡大します。
Protocol
Representative Results
Discussion
創傷治癒および再生のモデルとしてNematostellaの使用は、ますます人気が高まっています。したがって、効果的な細胞および分子分析は、割り当てと比較することができる前に、特定のプロトコルの形態学的パターンを可視化できることが重要です。生活の後プラヌラの段階で、ほぼすべての場所で切断し、不足している構造を改革することができるという、回生「柔軟性」の高い学位?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、GHTにニューヨーク幹細胞科学（NYSTEM C028107）グラントによってサポートされていました。
Materials
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
| Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
| Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
| Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |
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