Наводить Complete полипа Регенерация от спинных Physa из Starlet актинии<em> Nematostella vectensis</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Стрекающие, и , в частности Hydra, были первыми животными , показанные для регенерации поврежденных или разорванных структур, и действительно такие исследования , возможно , запускаемые современный биологический запрос через работу Трамбле более 250 лет назад. В настоящее время исследование регенерации видел возрождение с использованием как "классические" регенеративные организмы, такие как гидры, планарий и хвостатых, а также расширяющийся спектр видов , охватывающих диапазон от многоклеточных, губок через млекопитающих. Кроме того, ее внутренний интерес как биологическое явление, понимание того, как регенерация работает в различных видах будет информировать нас о том, разделяют регенеративные процессы общие черты и / или видов или контекстно-зависимые клеточные и молекулярные механизмы. Актинии стерлядь, Nematostella vectensis, является новой моделью организма к регенерации. Как Hydra, Nematostella является членом древнего филюма, книдарий, но в тон класс Anthozoa, сестра клады к Нуйгогоа, которая является эволюционно более базальной. Таким образом , аспекты регенерации в Nematostella будет интересно сравнить и сопоставить с теми гидры и других кишечнополостных. В этой статье мы представляем метод Bisect, наблюдать и классифицируют регенерацию аборальной конца взрослого Nematostella, который называется physa. Physa естественным образом подвергается делению как средство бесполого размножения, а также естественное деление или ручной ампутация physa вызывает возобновление роста и реформирование сложных морфологией. Здесь мы кодифицированы эти простые морфологические изменения в системе Staging Nematostella регенерации (The NRSS). Мы используем NRSS, чтобы проверить влияние хлорохин, ингибитор лизосомных функции, которая блокирует аутофагии. Результаты показывают, что регенерация полип структур, в частности мезентериев, ненормально, когда аутофагия ингибируется.

Introduction

Наблюдение регенерации в одной гидры была знаковым событием в биологии появления как экспериментальной науки ^1,2. Регенерация остается явление чрезвычайно широкое обращение к биологу и мирянина, так. Потенциал для онтогенетики, клиницистов, биомедицинской ученых и инженеров ткани , чтобы понять и преодолеть ограничения на регенерации человека делает регенерацию биологии более чем внутренне интересно.

Теперь, с использованием новейших технологий, таких как секвенирование генома и усиления и потери функциональных инструментов, поле готова дразнить друг от друга регенеративные механизмы и в конечном счете понять, как различные виды могут регенерировать в то время как другие не могут. Степень общности в молекулярном, клеточном и морфологических реакций еще предстоит выяснить, но до сих пор кажется, что основные реакции среди животных, которые могут регенерировать более похожи, чем был бы томографовНед только десять лет назад ^3.

Стрекающие, в частности, являются снисходительный при регенерации почти все их части тела на фоне широкого спектра морфологического разнообразия. Из одиночного полипа пресной воды, Hydra вместе с крошечных морских полипов, которые строят огромные коралловые рифы, до сложных колониальных сифонофор, таких как Португальской Man-O-War, регенерация часто является способом размножения, в дополнение к механизму ремонта или реформирования поврежденных или утраченных частей тела в результате травмы и хищничества. Являются ли различные виды книдарий используют сходные или различные механизмы для регенерации принципиально интересный вопрос ^4-6.

Мы, и другие были разработки anthozoan, Nematostella vectensis в качестве модели для регенерации ^7-17. Недавно мы разработали систему определения стадии для описания регенерации всего тела от морфологически однородного куска ткани надвое от Aboraл конец полипа ^10. В то время как Nematostella полипы могут регенерировать , когда разрезанный на любом уровне, мы решили сократить взрослых на аборальной позиции в наиболее морфологически простого региона, physa, отчасти потому , что это близко к нормальной плоскости естественного бесполого деления ^18, а также из – за него наблюдение разрешений и молекулярный анализ того, как все тело повторно собраны от простейших морфологических компонентов.

Балетмейстер система Nematostella Регенерация (NRSS) обеспечивает относительно простой набор морфологических критериев , которые могут быть использованы , чтобы выиграть прогресс любого аспекта регенерации путем ампутированной physa, при нормальных условиях культивирования или экспериментально возмущенных ситуаций , таких как небольшие лечения молекулы, генетических манипуляций или экологического изменения. Как и ожидалось, NRSS становится принята в качестве морфологического помост, на котором можно ссылаться на клеточные и молекулярные события регенерации10.

Наконец наш метод резки производит зияющую дыру на несколько порядков больше , чем контактный точки прокола , используемой в недавнем исследовании ^17, но оба раны заживают в течение около 6 часов. Документирование визуально арестовывая и отдельные фазы закрытия раны следует предложить экспериментальные подходы для объяснения кажущейся независимости от размера раны и времени, которое требуется, чтобы закрыть. Таким образом, более глубокое визуальное понимание аборальной процесса ампутации, предусмотренных этим протоколом, будет способствовать дальнейшие исследования в этой системе регенерации модели и расширить применение этой системы с использованием промежуточной Nematostella vectensis.

Protocol

1. Кондиционер животных для температуры, питания и цикл свет / темнота Получить Nematostella vectensis взрослых от одного из многочисленных лабораторий Nematostella по всему миру, или поставщика некоммерческий (таблица 1) Поддерживать Nematostella при постоянной температур…

Representative Results

Прогрессирование морфологических событий во время регенерации в отрезанной physa показана на рисунке 1А, который включает в себя представительные вид physa на каждом этапе NRSS. Типичный сайт physa разрез показан на взрослого (Arrowheads). На фотографиях на рисунке 1А</s…

Discussion

Использование Nematostella в качестве модели заживления ран и регенерации становится все более популярным. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность визуализировать морфологические закономерности конкретного протокола, прежде чем эффективных клеточных и молекулярных анализов м?…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification