Summary

विधानसभा और 'कतरें छल्ले' के आवेदन: कक्षीय, यूनिडायरेक्शनल और समय-समय पर द्रव का प्रवाह और कतरनी तनाव के लिए एक उपन्यास Endothelial मॉडल

Published: October 31, 2016
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Summary

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Abstract

अनुकूली के साथ ही endothelial phenotype और जीन अभिव्यक्ति में रोग परिवर्तन उत्प्रेरण द्वारा सामान्य स्तर और नाड़ी शरीर विज्ञान और pathophysiology में संवहनी द्रव कतरनी खेलने महत्वपूर्ण भूमिकाओं के पैटर्न से विचलन। विशेष रूप से, समय-समय पर, दिशाहीन प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के प्रभाव maladaptive कई संवहनी सेल प्रकार, विशेष रूप से endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव की एक किस्म को गति प्रदान कर सकते हैं। अब तक विविध शारीरिक मूल से endothelial कोशिकाओं सुसंस्कृत किया गया है, में गहराई से तरल पदार्थ कतरनी को अपनी प्रतिक्रिया कतरनी मॉडल के रिश्तेदार जटिलता के द्वारा बाधा उत्पन्न की है का विश्लेषण करती है (जैसे, समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष, कोन और प्लेट प्रवाह मॉडल)। जबकि इन सभी उत्कृष्ट दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस तरह के मॉडल तकनीकी रूप से जटिल हैं और अपेक्षाकृत लंबी और जटिल सेटअप समय, कम सतह क्षेत्रों, पंप और दबाव अक्सर sealants और गास्केट की आवश्यकता के लिए आवश्यकताओं सहित खामियों से ग्रस्त हैं, बीओटी के लिए चुनौतियों का निर्माणबाँझपन और कई प्रयोगों को चलाने में असमर्थता की ज रखरखाव। हालांकि, अगर प्रवाह और कतरनी की उच्च throughput मॉडल उपलब्ध, संवहनी endothelial कतरनी प्रतिक्रियाओं पर अधिक से अधिक प्रगति थे, आणविक स्तर पर विशेष रूप से समय-समय पर कतरनी अनुसंधान, और अधिक तेजी से उन्नत हो सकता है। एक उपन्यास, सरल करने के लिए इकट्ठा, और सस्ती टिशू कल्चर मॉडल एक अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र है कि आसानी से दिशाहीन, समय-समय पर कतरनी तनाव पर अध्ययन में प्रयोगात्मक प्रतिकृति के एक उच्च संख्या के लिए अनुमति देता है के साथ: यहाँ, हम निर्माण और उपयोग कतरनी के छल्ले के वर्णन अन्तःस्तर कोशिका।

Introduction

सीआईएस नियामक तत्व 6 की सक्रियता, हिस्टोन acetyltransferase गतिविधि 7 और कतरनी तनाव प्रतिक्रिया तत्वों (SSRE) 8 के माध्यम से 5 द्रव कतरनी तनाव endothelial जीन कार्यक्रमों मिलाना 1 दिखाया गया है। ऊतक कारक 9 और ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) 10 अभिव्यक्ति नियमन द्वारा जमावट की ओर endothelial योगदान कतरनी तनाव को प्रभावित करती है। कतरनी तनाव भी PDGF-बी संश्लेषण और जवाबदेही 8 विनियमन द्वारा angiogenesis 11 और पोत remodeling के नियंत्रण को प्रभावित करती है। Endothelial व्युत्पन्न vasoactive मध्यस्थों Adrenomedullin, endothelin -1, urotensin द्वितीय और relaxin भी द्वारा कतरनी 12 विनियमित रहे हैं। Endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase उत्पादन और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन का प्रतिलेखन दोनों कतरनी निर्भर 10 हैं। कतरें भी endothelial ICAM-1 अभिव्यक्ति 13 को नियंत्रित करता है। प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव इसलिए शक्तिशाली नेटवर्क को मजबूत कर सकते हैंlly endothelial प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी विविधता को प्रभावित करती है। महत्वपूर्ण बात है, नाड़ी स्पंदन अब भी दोनों सामान्य संवहनी उम्र बढ़ने और नाड़ी मनोभ्रंश 14 के रूपों के pathophysiology में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाई देते हैं और यहां तक कि इस तरह के एकाधिक काठिन्य 15 के रूप में अन्य neurodegenerative रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं।

शिरापरक और धमनी endothelial कोशिकाओं स्वाभाविक विवो में विविध रक्तसंचारप्रकरण प्रवाह पैटर्न को उजागर कर रहे हैं, और कई अलग अलग endothelial सेल phenotypes 16 प्रदर्शित किया जा सकता है। परिमाण और प्रवाह की अवधि पर निर्भर करता है, endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव भड़काऊ सेल सक्रियण और apoptosis, जो जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति 17,18 में बदलाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं शामिल हो सकते हैं। Endothelial सेल प्रतिक्रिया पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल है कि पर्याप्त रूप से इस तरह के कतरनी पैटर्न का उत्पादन में उत्पादन में घटना इसलिए कठिनाइयों से जटिल रह वंचित करने के लिए।

कई अलग अलग experimental प्रोटोकॉल सेल monolayers endothelial के लिए तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू करने के लिए विकसित किया गया है। 21 सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रणालियों में से एक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष हैं, जिनमें कक्ष 19 के भीतर वर्दी लामिना का प्रवाह पैदा करता है। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप आमतौर पर आवधिक प्रवाह है, जो प्रवाह विशेषताओं को आम तौर पर इन विवो 22 में कई स्थानों में पाया पुनरावृत्ति कर सकते हैं बनाने से जुड़ा है। एक अन्य आम सेट-अप 'कोन और प्लेट' मॉडल है, जहां तरल पदार्थ कतरनी तनाव शंकु 23 की घूर्णन गति से निर्धारित होता है उपयोग करता है। दोनों प्रणालियों, और अन्य व्यवस्थाओं के लिए उन्हें समान है, की स्थापना की और घटक है कि अपेक्षाकृत महंगा है और कई प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम हो सकता है की आवश्यकता के लिए कठिन हो सकता है।

इन मौजूदा मॉडलों का एक अन्य प्रमुख सीमा को दोहराने के अध्ययन है कि एक साथ एक अपेक्षाकृत कम सतह क्षेत्र के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, प्रत्येक की अपेक्षाकृत कम संख्या है। इस बार और सह बढ़ जाती है इस तरह के दृष्टिकोण के mplexity। इसलिए, कि दिशाहीन और समय-समय पर कतरनी लाती एक आदर्श मॉडल एक अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र के साथ एक है जहाँ अध्ययन प्रतिकृति के एक उच्च संख्या आसानी से स्थापित किया जा सकता है, प्रत्येक हो सकता है। इसके अलावा, ऊपर उल्लिखित मॉडल एक काफी परिष्कृत सेटअप है, जो कई उपयोगकर्ताओं के लिए लागत निषेधात्मक हो सकता है की आवश्यकता होती है। एक मॉडल है कि बुनियादी प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग कर तरल पदार्थ कतरनी गड़बड़ी उत्पादन कर सकते हैं कई फायदे हो सकता है।

दिशाहीन, समय-समय पर कतरनी तनाव को लागू करने का एक सरल और अत्यधिक किफायती तरीका एक कक्षीय प्रकार के बरतन 24 पर परिपत्र व्यंजनों की नियुक्ति शामिल है। इस प्रोटोकॉल बहुत सरल है और जरूरत के रूप में बढ़ाया जा सकता है उच्च संख्या के अध्ययन के प्रतिकृति, एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र की सतह के साथ प्रत्येक को प्राप्त करने के लिए। हालांकि, डिश के केंद्र में स्थित कोशिकाओं परिधि के साथ कोशिकाओं की तुलना में अलग प्रवाह पैटर्न को उजागर कर रहे हैं, एक ही थाली में मिश्रित सेलुलर प्ररूपी प्रतिक्रियाओं से बेदखल।

_content "> इस वर्तमान रिपोर्ट में, हम निर्माण और 'कतरनी के छल्ले', दिशाहीन और समय-समय पर कतरनी तनाव पैदा करने के लिए हमारे मॉडल के उपयोग कतरनी की अंगूठी के लिए प्रभावी ढंग से सीमा 'मिश्रित' सेलुलर कतरनी प्रेरित phenotypes प्रवाह सीमित द्वारा वर्णन करते हैं। डिजाइन एक इनर रिंग के प्लेसमेंट के माध्यम से परिधि को एक परिपत्र संस्कृति डिश के भीतर मार्ग। निर्माण और कतरनी अंगूठी के संचालन को सरल और किफायती है और आसानी से व्यापक रूप से उपलब्ध टिशू कल्चर की आपूर्ति का उपयोग कर कक्षीय शेकर्स की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस मॉडल शारीरिक और pathophysiological स्तर के भीतर दिशाहीन और आवधिक प्रवाह पैटर्न प्रदान करने के लिए endothelial सेल प्रयोगों में लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. 150 मिमी व्यास कतरें अंगूठियों का निर्माण (चित्रा 1) नोट: कतरें के छल्ले, बाहरी और भीतरी पेट्री डिश आकार बदलती अलग कुल सतह क्षेत्रों, सेल पैदावार के साथ उपकरणों में जिसके परिणामस्वरूप और विकसित…

Representative Results

यहाँ हम दोनों hCMEC / डी 3 मस्तिष्क endothelial सेल और चूहे रेटिना microvascular endothelial सेल monolayers, कतरनी के छल्ले में सुसंस्कृत से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं। hCMEC / डी 3 मस्तिष्क endothelial से?…

Discussion

endothelial कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के लिए कतरनी कतरनी अंगूठी प्रणाली के निर्माण कतरनी तनाव के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए एक सरल तरीका है। फिर भी, वहाँ कुछ कदम है कि बेहतर कतरनी के छल्ले और बेहतर परिणाम प्र?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों श्री क्रिस्टोफर गुयेन, हारून हंटर और Shreveport जम्पस्टार्ट, स्मार्ट, और Biostart प्रशिक्षण कार्यक्रमों की सहायता के साथ-साथ लुइसियाना के शताब्दी कॉलेज बायोफिज़िक्स, Shreveport, ला विभाग को स्वीकार करना होगा।

Materials

100 x 20 mm plastic tissue culture dish Corning 430167 The dishes must be polystyrene
150 x 25 mm plastic tissue culture dish Corning 430599 The dishes must be polystyrene
150 mm glass petri dish  Fisher 3160150BO
15ml polystyrene tissue culture plastic tubes Falcon 352099
Methylene chloride Sigma-Aldrich D65100
silicone rubber sealant DAP 7079808641
ethanol Decon 2701
3 mL transfer pipette Becton-Dickinson 357524
printer paper
scissors
gloves
rotary tool and set Dremel 4000-6/50
rotary tool cutting head Dremel EZ476
rotary tool drill head
distilled water
orbital shaker VWR 57018-754
incubator
Rat retinal microvascular endothelial cells Cell Biologics RA-6065

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White, L. A., Stevenson, E. V., Yun, J. W., Eshaq, R., Harris, N. R., Mills, D. K., Minagar, A., Couraud, P., Alexander, J. S. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. J. Vis. Exp. (116), e54632, doi:10.3791/54632 (2016).

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