Forsamlingen og anvendelse af 'Shear Rings ": A Novel Endothelial Model for Orbital, ensrettet og periodisk Fluid Flow og Shear stress
Summary
Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Abstract
Afvigelser fra normale niveauer og mønstre for vaskulære væske play shear vigtige roller i vaskulær fysiologi og patofysiologien ved at inducere adaptive samt patologiske ændringer i endothelial fænotype og genekspression. Især kan maladaptive virkninger af periodiske, ensrettet flow induceret forskydningsspænding udløse en række virkninger på flere vaskulære celletyper, især endotelceller. Mens nu endotelceller fra forskellige anatomiske oprindelser har været dyrket, dybdegående analyser af deres svar på væske forskydning er blevet vanskeliggjort af den relative kompleksitet shear modeller (f.eks parallel plade flow kammer, kegle og plade flow-model). Mens disse alle repræsenterer fremragende tilgange, disse modeller er teknisk kompliceret og lider af ulemper, herunder relativt langvarig og kompliceret setup tid, lave arealer, krav til pumper og overtryk ofte kræver fugemasser og pakninger, hvilket skaber udfordringer for both vedligeholdelse af sterilitet og en manglende evne til at køre flere eksperimenter. Men hvis højere gennemløb modeller af flow og shear var til rådighed, større fremskridt på vaskulær endotel shear reaktioner, især periodisk forskydning forskning på det molekylære niveau, kunne være hurtigere avancerede. Her beskriver vi konstruktionen og anvendelsen af shear ringe: en roman, enkel-til-samle og billig vævskultur model med et relativt stort areal, der nemt giver mulighed for et stort antal eksperimentelle gentagelser i ensrettede, periodisk forskydning stress undersøgelser endotelceller.
Introduction
Væske forskydningsspænding er blevet vist at modulere endoteliale genprogrammer 1 – 5 ved aktivering af cis-regulatoriske elementer 6, histonacetyltransferase aktivitet 7 og shear-stress responselementer (SSRE) 8. Forskydningsspænding påvirkninger endotelceller bidrag til koagulation ved at modulere vævsfaktor 9 og vævsplasminogenaktivator (tPA) 10 ekspression. Shear stress påvirker også kontrol af angiogenese 11 og fartøj remodellering ved at regulere PDGF-B-syntese og reaktionsevne 8. Den endotel afledte vasoaktive mediatorer Adrenomedullin, endothelin-1, urotensin II og relaxin er også reguleret af forskydning 12. Transskription af endotel nitrogenoxid syntase produktion og nitrogenoxid produktion er både forskydning afhængige 10. Shear styrer også endotel ICAM-1-ekspression 13. Flow-induceret forskydningsspænding kan derfor kraftflly påvirke en lang række endotheliale responser. Vigtigere, vaskulære pulsationer nu også synes at spille en vigtig rolle i patofysiologien af både normal vaskulær ældning og parternes vaskulær demens 14 og kan endog bidrage til andre neurodegenerative sygdomme, såsom multipel sklerose 15.
Venøse og arterielle endothelceller ifølge sagens natur udsat for forskellige hæmodynamiske strømningsmønstre in vivo, og mange forskellige endotheliale cellefænotyper kan udstilles 16. Afhængig af størrelsen og hyppigheden af flow, kan virkninger på endothelceller omfatter inflammatorisk celle aktivering og apoptose, hvilket kan afspejle ændringer i gen eller protein-ekspression 17,18. Undersøgelser af endotel celle responser at forskyde fænomener derfor forblive kompliceres af vanskelighederne i at producere in vitro modeller, der i tilstrækkelig grad producerer sådanne shear mønstre.
Mange forskellige experimental protokoller er blevet udviklet til at anvende fluid forskydningsspænding endotel cellemonolag. En af de mest anvendte systemer er parallelle plader strømningskammeret, hvilket skaber ensartet laminar strømning i kammeret 19 -. 21 En peristaltisk pumpe er typisk forbundet til at skabe periodiske strømning, som kan rekapitulere strømningsegenskaber typisk findes i mange steder i vivo 22. En anden almindelig opsætning anvender 'kegle og plade' model, hvor forskydningsspænding fluidum bestemmes af rotationshastigheden for keglen 23. Begge systemer, og andre arrangementer, der ligner dem, kan være trættende at sætte op og kræver komponenter, der kan være relativt dyre og utilgængelige for mange laboratorier.
En anden væsentlig begrænsning af disse nuværende modeller er det relativt lave antal replikater undersøgelser, der kan udføres samtidigt, hver med et relativt lavt overfladeareal. Dette forøger den tid og co mplexity af sådanne tilgange. Derfor kan en ideel model, der inducerer ensrettet og periodisk forskydning være et, hvor et stort antal studier replikater kan let oprettes, hver med et relativt stort overfladeareal. Desuden de førnævnte modeller kræver en temmelig sofistikeret setup, som kan være omkostningseffektive uoverkommelige for mange brugere. En model, der kan producere forstyrrelser væske shear ved hjælp af grundlæggende laboratorium materialer kan have flere fordele.
En enkel og meget økonomisk fremgangsmåde til at påføre ensrettet, periodisk forskydningsspænding indebærer placeringen af cirkulære retter på en orbitalryster 24. Denne protokol er meget enkel og kan skaleres op for at opnå høje numre af undersøgelsen replikater, hver med et relativt stort overfladeareal, som er nødvendigt. Imidlertid er celler beliggende i centrum af skålen udsat for forskellige strømningsmønstre end celler langs periferien, hvilket gav blandede cellulære fænotypiske responser i samme skålen.
_content "> I denne aktuelle rapport beskriver vi konstruktionen og anvendelsen af 'shear ringe', vores model til at skabe ensrettet og periodisk forskydningsspænding. Designet for shear ringen effektivt begrænser" blandet "cellulære shear-induceret fænotyper ved at begrænse strømmen pathway i en cirkulær dyrkningsskål til periferien gennem placeringen af en indre ring. konstruktionen og driften af shear ring er simpel og økonomisk og let kan skaleres til at rumme en lang række orbital shakers benyttes alment tilgængelige vævskulturplader forsyninger. Denne model kan anvendes i endotheliale celle eksperimenter for at tilvejebringe ensrettede og periodiske strømningsmønstre inden for fysiologiske og patofysiologiske niveauer.Protocol
Representative Results
Discussion
Konstruktionen af shear ringsystem til eksponering endothelceller for forskydning er en enkel fremgangsmåde til udførelse af forskydningsspænding undersøgelser. Alligevel er der et par trin, der er afgørende for at opnå overlegne shear ringe og bedre resultater. bør foretages en fuldstændig tætning mellem den indre og ydre ring for at forhindre medier fra utæt, der kunne skabe inkonsekvent forskydningsspænding blandt prøver. Hvis et komplet tætning ikke stilles, skal en minimal mængde methylenchlorid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Mr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter og Shreveport Jumpstart, SMART, og Biostart træningsprogrammer samt Centenary College of Louisiana afdeling for Biofysik, Shreveport, LA.
Materials
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium. Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
