총회와 '전단 반지'의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

요약

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

초록

적응뿐만 아니라 내피 표현형과 유전자 발현의 병리학 적 변화를 유도하여 정상 수준 및 혈관 생리학 및 병태 생리에 혈관 유체 전단 중요한 역할을 패턴에서 편차. 특히주기적인 단방향 흐름 유도 된 전단 응력의 영향은 여러 부적응 혈관 세포 형태, 특히 혈관 내피 세포에 대한 다양한 효과를 트리거 할 수있다. 지금까지 다양한 해부학 적 기원에서 내피 세포 배양되었지만, 깊이있는 유체 전단에 자신의 응답이 전단 모델의 상대적 복잡성에 의해 방해 한 분석 (예를 들어, 평행 판 유량 용기, 콘 플레이트 흐름 모델). 이러한 모든 훌륭한 접근 방식을 나타내는 반면, 이러한 모델은 봇에 도전을 작성, 기술적으로 복잡하고 상대적으로 길고 복잡한 설정 시간, 낮은 표면 영역, 자주 밀봉 가스켓을 필요로하는 펌프 및 가압에 대한 요구 사항을 포함하여 결점불임 여러 실험을 실행하기 위해 무능력의 시간 유지. 흐름과 전단의 높은 처리량 모델은 혈관 내피 전단 반응에 큰 진전 사용할 수 있었던 경우에는, 분자 수준에서 특히주기적인 전단 연구는보다 신속하게 고급 수 있습니다. 쉽게에 단방향,주기적인 전단 응력 연구에서 실험 복제의 높은 숫자를 허용하는 비교적 큰 표면적 소설, 간단한 - 투 조립, 저렴한 조직 문화 모델 : 여기, 우리는 건설 및 사용 전단 링을 설명 내피 세포.

서론

시스 - 조절 요소 ^(6)의 기동, 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 활성 ⁽⁷⁾ 및 전단 응력에 응답 요소 (SSRE) ^{5-8 -} 유체 전단 응력은 내피 유전자 프로그램 ^1을 조절하는 것으로 나타났다. 조직 인자 ⁽⁹⁾ 및 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) ⁽¹⁰⁾ 식을 변조함으로써 응력의 영향을 응고 향해 내피 기여 전단. 전단 응력은 PDGF-B의 합성 및 응답 ^(8)을 조절함으로써 혈관 신생 ^(11)와 선박 개조의 제어에 영향을 미친다. 내피는 엔도 텔린-1, 유로 텐신 II 및 relaxin도 전단 ^(12)에 의해 혈관 활성 매개체의 adrenomedullin 규제 유도. 내피 산화 질소 합성 효소의 생산 및 산화 질소 생산의 전사는 모두 전단 의존 ^10이다. 전단은 내피 세포의 ICAM-1의 발현 ^{(13)를 제어한다.} 따라서 powerfu 수 있습니다 흐름에 의한 전단 응력에서야 베드로 내피 응답의 큰 다양성에 영향을 미친다. 중요한 혈관 맥동 이제도 ¹⁴ 혈관성 치매 모두 정상 혈관 노화 형태의 병태 생리에....

프로토콜

150mm 직경 전단 반지의 1. 건설 (그림 1)

주 : 전단 링은 외측 페트리 접시 크기를 변화 상이한 총 표면적 세포 수율 장치에서 생성 및 전단력의 범위를 개발하여 다양한 크기를 생성하도록 구성 될 수있다. 이 보고서는 98cm ² (그림 2)의 전체 면적에 대한 내부 100mm 접시와 결합 된 150mm 요리에 대해 설명합니다.

도 1 전단 링 조립체. 도면의 상부에는 부분적으로 조립 된 전단 고리를 나타낸다. 단단한 시일이 완전 내외 식기 사이에 형성되지 않은 경우 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입한다. 전단 고리 내측 주위 EDG 실리콘 고무 접착제의 두께 1㎜ 비드를 적용하여 정지 밀봉전단 링 상단의 전자. 도면의 하단 부분은 조립 전단 고리를 나타낸다. 청색 도금 내피 세포의 영역을 나타낸다. 외부 및 내부 빨간색 화살표가 ....

결과

여기에서 우리는 전단 링에서 배양 hCMEC / D3 뇌 내피 세포와 쥐의 망막 미세 혈관 내피 세포 단일 층 모두에서 대표적인 결과를 제시한다.

hCMEC / D3 뇌 내피 세포 단층이 완전한 EBM에 합류하도록 성장시킨 후, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산 이었다 매개 변수를 사용하여 약 2.8 다인 / cm ² ( = 0.95 cm,

토론

전단 내피 세포를 노출 전단 고리 시스템의 구성은 전단 응력의 연구를 수행하는 간단한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 우수한 전단 반지와 더 나은 결과를 얻기위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 완전 밀봉 된 샘플간에 일치 전단 응력을 생성 할 수있는 미디어 누출을 방지하기 위해 내부 및 외륜 사이에 만들어 져야한다. 완벽한 밀봉이 수행되지 않은 경우, 메틸렌 클로라이드의 최소량은 내부 링의 구멍을 통하여 전달 피펫으로 내부와 외부 사이의 접시 가장자리에 첨가되어야한다. 부드럽게 메틸렌 클로라이드 완전한 시일을 형성 할 수 있도록한다 조정기. 또한, 실수로 절단에서 생산되는 플라스틱 부스러기, 전단 링 트랙에 존재할 수 있으므로 부정적인 세포 성장에 영향을 일관성 전단 응력 애플리케이션을 줄 수있는 이물질을 제거해야합니다 건설 후 전단 링을 세척.

의 S문서에 설명 듣고 링은 샘플 당 출력의 높은 볼륨으로 이어지는, 크기가 상대적으로 크다. 그러나 작은 버전은 작은 배양 접시.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 x 20mm 플라스틱 조직 배양 접시	Corning	430167	접시는 폴리스티렌이어야 합니다
150 x 25mm 플라스틱 조직 배양 접시	Corning	430599	접시는 폴리스티렌
150mm 유리 페트리 접시	Fisher	3160150BO
15ml 폴리스티렌 조직 배양 플라스틱 튜브	Falcon	352099
염화메틸렌	Sigma-Aldrich	D65100
실리콘 고무 실란트	DAP	7079808641
에탄올	Decon	2701
3ml 전사 피펫	Becton-Dickinson	357524
프린터 종이
가위
장갑
회전 도구 및 세트	Dremel	4000-6/50
회전 도구 절단 헤드	Dremel	EZ476
회전 도구 드릴 헤드
증류수
궤도 셰이커	VWR	57018-754
인큐베이터
쥐 망막 미세 혈관 내피 세포	세포생물학제	RA-6065

여야 합니다