मानव hepatocellular कार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 के साथ एक तीन आयामी लिवर मॉडल repopulated में वायरल वैक्टर का अध्ययन
Summary
The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Abstract
इस प्रोटोकॉल एक तीन आयामी (3 डी) की पीढ़ी के पूर्व vivo जिगर मॉडल और अध्ययन और वायरल वेक्टर प्रणालियों के विकास के लिए अपने आवेदन का वर्णन है। मॉडल एक मानव hepatocyte सेल लाइन के साथ एक decellularized चूहा जिगर के बाह्य मैट्रिक्स repopulating द्वारा प्राप्त की है। मॉडल एक vascularized 3 डी सेल प्रणाली में अध्ययन के लिए परमिट, रहने वाले जानवरों के साथ संभावित हानिकारक प्रयोगों की जगह ले। एक और लाभ यह मॉडल है, जो पशु मॉडलों की तुलना में मानव शरीर क्रिया विज्ञान के करीब है की humanized स्वभाव है।
इस अध्ययन में, हम एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी वेक्टर) से ली गई एक वायरल वेक्टर के साथ इस जिगर मॉडल के पारगमन प्रदर्शित करता है। छिड़काव सर्किट है कि मीडिया के साथ 3 डी मॉडल जिगर की आपूर्ति वेक्टर लागू करने के लिए एक आसान साधन प्रदान करता है। प्रणाली जिगर के प्रमुख चयापचय मापदंडों की निगरानी के लिए परमिट। अंतिम विश्लेषण के लिए, ऊतकों के नमूनों recellulariza की सीमा निर्धारित करने के लिए ले जाया जा सकताऊतकीय तकनीक द्वारा tion। वायरस वेक्टर और दिया transgene की अभिव्यक्ति का वितरण मात्रात्मक पीसीआर (qPCR), पश्चिमी सोख्ता और immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। बुनियादी अनुसंधान के क्षेत्र में और जीन चिकित्सीय अनुप्रयोगों के विकास में वेक्टर मॉडल के कई अनुप्रयोगों उपन्यास एंटीवायरल चिकित्सा विज्ञान के विकास, कैंसर अनुसंधान, और वायरल वैक्टर के अध्ययन और उनके संभावित दुष्प्रभावों सहित, कल्पना की जा सकती है।
Introduction
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
Protocol
Representative Results
Discussion
पुनर्गठन 3 डी यकृत यहाँ वर्णित एक humanized प्रणाली में वायरल वैक्टर अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करते हैं। एक मानव हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन के साथ एक चूहा जिगर के ईसीएम की Repopulation एक vascularized प्रणाली है जो बड़े बायोलॉजिक्स के अध्ययन परमिट उत्पन्न करता है। इन परिणामों के एक सबूत की अवधारणा है कि पुनर्गठन जिगर मॉडल कुशलता से एक वायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस जा सकती हैं।
यहाँ दिखाया प्रयोगों के लिए, जिगर के हर पालि एएवी वेक्टर द्वारा transduced किया गया था। हालांकि, कुछ प्रारंभिक प्रयोगों में, एकल पालियों कोशिकाओं के साथ repopulated नहीं थे। यह नाड़ी तंत्र occluding से सेल मलबे या अन्य घटकों को रोकने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। सभी पालियों भरकर रखा जा सकता है कि क्या परीक्षण करने के लिए, इस तरह के फिनोल लाल के रूप में एक गैर-विषाक्त डाई जिगर मॉडल के माध्यम से निकाले जा सकते हैं।
एक और महत्वपूर्ण बात जिगर पाड़ बाँझ रखे हुए है। जबकि इथेनॉल या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज disadv हैantageous नाड़ी तंत्र के लिए, γ विकिरण के साथ बाह्य मैट्रिक्स के विकिरण वाहिकाओं संरक्षित और नमूना निष्फल।
इसके अलावा, explanted यकृत का आकार, अलग है, इसलिए कि Recellularization प्रक्रिया और repopulation समय के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
चूहा वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल यकृत अपेक्षाकृत बड़े हैं और कोशिकाओं और परीक्षण अभिकर्मकों (जैसे, एएवी वैक्टर) की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, repopulation प्रक्रिया दो सप्ताह से अधिक ले लिया। यह प्रतिकृति जो उचित प्रयास के साथ किया जा सकता है की संख्या को सीमित करता है। वर्तमान में हम माउस यकृत, जो चूहे यकृत की मात्रा का केवल लगभग पांचवां रहे हैं के लिए मॉडल स्थापित कर रहे हैं, कम कोशिकाओं और कम परीक्षण अभिकर्मकों के उपयोग की अनुमति। हालांकि सेल नंबर की आनुपातिक पैमाने नीचे उचित लगता है, सही मात्रा furt में निर्धारित करने की आवश्यकताउसके प्रयोगों।
वर्तमान मॉडल की एक और कमी हेपैटोसेलुलर HepG2 सेल लाइन का इस्तेमाल होता है। प्रयोगों से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से भेदभाव hepatocytes है, जो एक physiologically अधिक प्रासंगिक मॉडल प्रदान करेगा के उपयोग को विकसित करने के लिए चल रहे हैं। इसके अलावा, जिगर hepatocytes, जैसे, Kupffer कोशिकाओं और sinosoids के अलावा अनेक प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं। हम मानते हैं कि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक वातावरण फिर से आबाद होगा जब एक ईसीएम अनेक प्रकार की कोशिकाओं के साथ recellularized है।
3 डी मॉडल जिगर कई लाभों को जोड़ती है। विवो मॉडल में पारंपरिक का एक बड़ा नुकसान है कि पशु शरीर क्रिया विज्ञान मानव शरीर क्रिया विज्ञान से काफी अलग है। एक मानव रोगी के उपचार के विषाक्त दुष्प्रभाव इसलिए नहीं चल पाता रह सकती है। इस कमी को मानव कोशिकाओं के साथ 3 डी जिगर मॉडल है कि और अधिक बारीकी से हू के जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित पुनर्गठन से दूर किया जा सकताआदमी रोगियों।
जिगर मॉडल का दूसरा लाभ यह पशु कल्याण के लिए अपने योगदान है। हालांकि पशु घटकों पुनर्गठन प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं, दृष्टिकोण अभी भी 3R सिद्धांत (प्रतिस्थापन, कमी, शोधन) के उद्देश्य के रूप में अधिशेष जानवरों है कि, अन्य पशु प्रयोगों के लिए बलिदान किया गया यानी, कोई अतिरिक्त जानवरों की जरूरत है और किया जा सकता है इस प्रकार है दृष्टिकोण पूरी तरह से जो अक्सर इन विवो प्रयोगों के साथ जुड़ा हुआ है जानवरों की पीड़ा से बचा जाता है। Spheroids एक 3 डी प्रणाली में सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प के उपकरण हैं। हालांकि, spheroids vascularized नहीं कर रहे हैं ताकि बड़े पदार्थों और बायोलॉजिक्स संरचना के भीतरी भागों में गहरी पैठ नहीं है। इन समस्याओं vascularized 3 डी जिगर मॉडल के साथ दूर किया गया है।
यहाँ वर्णित प्रयोगों में, एएवी वैक्टर, जांच की गई, क्योंकि वे जीन चिकित्सीय के लिए सबसे होनहार उम्मीदवारों में से एक हैंअनुप्रयोगों। के रूप में कई जीन चिकित्सकीय दृष्टिकोण जिगर को लक्षित है, जैसे, हेपेटाइटिस वायरस के साथ या अल्फा -1-ऐन्टीट्रिप्सिन की कमी के संक्रमण के उपचार के लिए उद्देश्य, 3 डी जिगर इन एएवी वेक्टर विकास की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह, ज़ाहिर भी अन्य hepatotropic वायरल वैक्टर, जैसे, adenoviral वैक्टर के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, यह इस तरह के हेपेटाइटिस बी या सी वायरस के रूप में संक्रामक हेपेटाइटिस वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह, उदाहरण के लिए, नई एंटीवायरल रणनीतियों डिजाइन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, 3 डी मॉडल अंग उपकरण का वादा किया नया cytostatic चिकित्सा कैंसर के इलाज के लिए और विषाक्तता अध्ययन बाहर ले जाने के लिए विकसित करने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं। लंबे समय पर, कृत्रिम यकृत प्रत्यारोपण के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा में इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ में ले ली, 3 डी मॉडल जिगर जैव चिकित्सा अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों संक्रमण जीव विज्ञान में आवेदन की एक विस्तृत रेंज प्रदान करता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Materials
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
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