Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Summary

Protein interaktioner er kernen i en celles funktion. Kalorimetriske og spektroskopiske teknikker er almindeligt anvendt til at karakterisere dem. Her beskriver vi fluorescensanisotropi som et værktøj til at studere interaktionen mellem proteinet muteret i Shwachman-Diamond Syndrome (SBD'er) og elongeringsfaktor-like 1 GTPase (EFL1).

Abstract

Protein-protein interaktioner spiller en væsentlig rolle i funktionen af ​​en levende organisme. Når en interaktion er blevet identificeret og valideret er det nødvendigt at karakterisere det på det strukturelle og mekanistiske niveau. Der findes flere biokemiske og biofysiske metoder til dette formål. Blandt dem, fluorescensanisotropi er en kraftfuld teknik anvendes især når fluorescensintensiteten af ​​en fluorofor-mærket protein forbliver konstant ved protein-protein-interaktion. Ved denne teknik en fluorofor-mærket protein exciteres med vertikalt polariseret lys med en passende bølgelængde, som selektivt exciterer en delmængde af de fluoroforer efter deres relative orientering med den indkommende stråle. Den resulterende emission har også en retningsvirkning hvis forhold i de lodrette og vandrette planer definerer anisotropi (r) som følger: r = (I _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), hvor jeg _VV og jeg <sub> VH er fluorescensintensiteterne af de lodrette og vandrette komponenter, hhv. Fluorescensanisotropi er følsom over for den roterende diffusion af en fluorofor, nemlig den tilsyneladende molekylstørrelse på en fluorofor bundet til et protein, der er ændret ved protein-protein-interaktion. I den nuværende tekst, blev brugen af ​​fluorescens anisotropi som et redskab til at studere protein-protein interaktioner eksemplificeret at løse bindingen mellem proteinet muteret i den Shwachman-Diamond syndrom (SBD'er) og Forlængelse faktor ligesom-1 GTPase (EFL1). Konventionelt mærkning af et protein med en fluorofor udført på thiolgrupper (cystein) eller i aminogrupperne (N-terminale amin- eller lysin) af proteinet. Men SBD'er har flere cysteiner og lysiner, der ikke tillader websted rettet mærkning af det. Som en alternativ teknik farvestoffet 4 ', var 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein anvendes til specifikt mærke et tetracysteine ​​motiv, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, gensplejses i C-terminalen af ​​det rekombinante SBD'er protein. Montering af de eksperimentelle data tilvejebragt kvantitative og mekanistisk information om den bindende tilstand mellem disse proteiner.

Introduction

Celler indeholder et væld af biomakromolekyler der konstant interagerer med hinanden. Denne forening giver anledning til komplekser, der deltager i cellulære veje, der er ansvarlige for deres funktion i signaltransduktion, regulering af genekspression og cellevandring blandt andre. Alle protein-protein interaktioner, der forekommer i en celle omfatter et netværk kendt som interactome. I Saccharomyces cerevisiae mere end 70% af dets proteiner er blevet vist at have interagerende partnere ^1. Forståelse af interactome af en celle og deres funktioner give relevante oplysninger om den kompleksitet og mangfoldighed af levende organismer. Adskillige metoder er blevet beskrevet til at identificere og karakterisere protein-protein interaktioner. Anderledes højkapacitetsscreening metoder såsom gær-to-hybrid ^2, protein-fragment komplementerings- assays ^3, affinitetsoprensning ⁴ koblet til massespektrometri og protein microarrays anvendes til at identificere en interaktion ^5,6. Når identificeret, er det nødvendigt at validere det og kan variere fra sag til sag. Typisk er disse eksperimenter involverer forstyrre interaktionen selv på niveau med de enkelte medlemmer af samspillet parret, fx ved gen-sletning eller overekspression af et af proteinerne, og derefter på udkig efter ændringer i egenskaber eller funktion af det andet medlem ved celleniveau. Efterfølgende biofysiske teknikker ⁷ anvendes til at karakterisere protein-protein-interaktion på det molekylære niveau. Til dette formål er strukturen af ​​proteinkomplekser bestemt ved røntgenkrystallografi, kernemagnetisk resonans og cryo-elektronmikroskopi mens kalorimetri og fluorescensspektroskopi anvendes til kvantitativt og mekanistisk beskrive dem.

I dette arbejde blev fluorescensanisotropi anvendt som en teknik til at karakterisere vekselvirkningen mellem GTPase EFL1 og SBDS-protein. Disse proteiner deltager i syntesen af ribosomer ved at fremme frigivelsen af eukaryot initieringsfaktor 6 fra overfladen af 60S ribosomale subunit ^8. Den SBD'er proteinet er muteret i en sygdom kendt som Shwachman-Diamond Syndrome ⁹ og virker som en guanin nukleotid udveksling faktor for EFL1 faldende dets affinitet for Guanosindifosfat ^10,11. Sygdomstilstande mutationer i SBD'er afskaffe interaktion med EFL1 og dermed forhindre dens aktivering.

Fluorescensanisotropi er almindeligt anvendt i biologiske anvendelser til at studere protein-peptid eller protein-nukleinsyre-interaktioner. Den er baseret på princippet om, at en fluorofor ophidset med polariserede lys resulterer i en delvist polariseret emission. Fluorescensanisotropi er defineret ved ligning 1:

hvor jeg _VV og jeg _VH er denfluorescensintensiteter af den vertikalt _(VV) og horisontalt _(VH) polariseret emission, når prøven er spændt med lodret polariseret lys ^12. Fluorescensanisotropi er følsom over for faktorer, der påvirker hastigheden af ​​den roterende diffusion af fluoroforen og således afhænger af temperaturen, viskositeten af ​​opløsningen og den tilsyneladende molekylstørrelse af fluoroforen. Den tilsyneladende størrelse af et protein indeholdende en fluorofor øges, når den interagerer med et andet protein og en sådan ændring kan derefter evalueres som en ændring i anisotropi. Mere specifikt vil en fluorofor, der roterer langsomt i opløsning i forhold til dets fluorescerende levetid har et stort I _VV værdi og lille I _VH-værdi, og derfor vil udvise en relativt stor anisotropi. For fluoroforer der tumler hurtigt i forhold til deres fluorescerende levetid, jeg _VV og jeg _VH vil være ens og deres anisotropi værdi vil være små ¹² </sup> (Figur 1). Endvidere for en god anisotropi signal-støj måling, er det nødvendigt at have en fluorofor med en fluorescenslevetid ligner rotationskorrelationstiden af ​​molekylet af interesse. Ellers er det ikke muligt præcist at registrere forskellen i anisotropi mellem den frie protein og at i komplekset. F.eks anisotropien af ​​en fluorescerende probe med en levetid tæt på 4 ns såsom fluorescein eller rhodamin bundet til en forbindelse med lav molekylvægt på 100 Da er 0,05. Binding til et molekyle på 160 kDa vil øge sin anisotropi værdi til 0,29; en forskel, der kan måles nøjagtigt. I modsætning hertil vil den samme fluorescerende probe involveret i en bindingsreaktion hvis forøgelse molekylstørrelse varierer fra 65 til 1.000 kDa kun resultere i en anisotropi ændring på 0,28 til 0,3, som er for lille til at blive målt nøjagtigt. I dette scenario vil en sonde med en levetid på 400 ns være mere passende ^12.

<pclass = "jove_content">
Figur 1. Skematisk gengivelse af det udstyr, der anvendes til at måle fluorescens-anisotropi og proceduren. Skematisk afbildning af udstyr, der anvendes til at udføre et protein-protein-interaktion eksperiment måling af fluorescens-anisotropi. Fluoroforer der tumler hurtigt display lille anisotropi, der øger efter binding til en interaktion partner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fluorescens applikationer kræver tilstedeværelsen af ​​en fluorofor i nogen af ​​de undersøgte molekyler. For at undersøge protein-protein interaktioner er der tre typer af fluoroforer: 1) de tryptophanrester stede i proteinerne, 2) kemisk forbundet fluoroforer og 3) fluorescerende fusionspartnere såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og dens derivativer. De fleste proteiner har tryptophanrester af strukturen, således den nemmeste måde at måle interaktion ved at overvåge ændringer i den tilsvarende fluorescens spektre eller ved at overvåge ændringer i fluorescensintensitet af de tryptophanrester. Dog kan tryptophanrester være til stede i begge proteiner komplicerer analysen. På den anden side, for en fluorofor at ændre sine fluorescerende egenskaber skyldes interaktion det skal være placeret på eller nær bindingsstedet og det kunne ændre på selve interaktion. Dette kræver særlig opmærksomhed ved brug af voluminøse fluoroforer såsom GFP. Hvis der kan anvendes ingen af ​​disse fluorophorer til bindingsundersøgelser er det nødvendigt, da, at indføre ekstrinsiske fluoroforer til en af ​​de involverede proteiner. Der findes mange kemisk syntetiserede fluorophorer og kan være kovalent bundet til proteiner via deres reaktive grupper såsom aminogrupper (sidekæde af lysiner eller N-terminus) og thiolgrupperne i cystein. Fluorophore derivater med isothiocyanatgrupperne og succinimidylestere reagerer med amidgrupper mens iodacetamid og maleimid er thiol-reaktive grupper ^13. De mest almindelige farvestoffer, der anvendes i fluorescens applikationer er derivater af fluorescein og rhodamin grønne farvestoffer, coumariner, BODIPY fluoroforer og Alexa Fluor farvestoffer. En detaljeret liste over kommercielt tilgængelige fluorophorer og deres anvendelse kan findes i referencer ^14,15. For vellykket mærkning, skal den reaktive gruppe eksponeres på overfladen af ​​proteinet, men på grund af det store antal reaktive funktionelle grupper typisk er til stede i polypeptider er det meget svært at få stedspecifik modifikation. Proteinet af interesse i denne undersøgelse, SBD'er, indeholder 5 gratis cysteiner og 33 lysiner der kan resultere i flere mærkning site. Ikke-ensartet mærkning kan påvirke bindende og vil komplicere dataanalyse som forskellige fluoroforen molekyler kan fremkalde forskellige fluorescerende intensitet signaler efter binding. Overcome dette problem, brugte vi blitzen fluoroforen, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein til site-direkte etiketten SBD'er protein. Dette er en arsenoxide farvestof med en høj affinitet for fire adskilte cysteiner i et motiv kender som Flash-tag bestående af sekvensen CCXXCC hvor X er andet end cystein ^16,17 aminosyre. Denne tetracysteine ​​motiv tilsættes til N- eller C-terminalen af ​​proteinet ved gensplejsning sammen med en passende linker til at forhindre forstyrrelse af den samlede foldning af proteinet. Parret bestående af Flash farvestof og Flash-tag blev oprindeligt designet til stedspecifikke label proteiner i levende celler ^17, men det kan også bruges til at mærke oprensede proteiner in vitro som det er eksemplificeret her. Yderligere er enzymatiske strategier også blevet udviklet for at muliggøre stedspecifik funktionalisering af proteiner ^18.

I dette manuskript beskriver vi nytten af ​​fluorescensanisotropi asa værktøj til at studere protein-protein-interaktioner. Binding kan vurderes ved simpel inspektion af bindende kurveform mens kan fås kvantitative oplysninger fra pasningen af ​​eksperimentelle data.

Protocol

1. SBD'er-Flash tag Protein Expression og oprensning BEMÆRK: anisotropien eksperimenter, en flash-tag svarende til sekvensen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys blev tilsat til C-terminalen af ​​de humane SBD'er kodende sekvens ved PCR. Denne konstruktion blev subklonet ind i ekspressionsvektoren pRSET-A og transformeret til Escherichia coli C41-celler til at udtrykke et protein der koder for et N-terminalt hexahistidin tag (His-tag), de humane SBD'er kodende sekvens og en C-terminus Flash tag 1…

Representative Results

At udføre nogen anisotropi eksperiment er det vigtigt at udelukke store ændringer i fluorescensintensitet af fluoroforen siden observerede anisotropi af en blanding af forskellige arter er repræsenteret af ligning 5: hvor F i repræsenterer fraktioneret fluorescens af hver kompon…

Discussion

De fleste biokemiske eksperimenter med proteiner kræver ikke kun rent protein, men også store mængder af dem, uanset hvilken teknik der anvendes. Af denne grund er de proteiner, der anvendes til denne type eksperimenter opnået ved heterolog ekspression, som det var tilfældet præsenteres her. Fluorescens spektroskopi kræver tilstedeværelse af en fluorofor i den undersøgte molekyle. Aromatiske rester udgør iboende fluoroforer af et protein, men ved hjælp af deres signal for at studere protein-protein-interaktio…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox