Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון
Summary
אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חיוני בתפקוד של אורגניזם חי. לאחר אינטראקציה זוהתה ומאומתים יש צורך לאפיין אותה ברמה המבנית מכניסטית. שיטות ביוכימיות biophysical קיימות מספר למטרה זו. ביניהם, אנאיזוטרופיה הקרינה היא טכניקה רבת עוצמה המשמש במיוחד כאשר עוצמת הקרינה של חלבון שכותרתו fluorophore נשאר קבוע על אינטראקציה בין חלבונים. בטכניקה זו, חלבון שכותרתו fluorophore הוא נרגש עם אור מקוטב האנכי של אורך גל מתאים באופן סלקטיבי שמרגש משנה של fluorophores לפי נטיותיהם היחסיות עם אלומת האור הנכנסת. פליטת וכתוצאה מכך יש גם כיווניות שהיחסים המוקדמים ב המטוסים אנכיים ואופקיים מגדיר אנאיזוטרופיה (r) כדלקמן: r = (אני VV -אני VH) / (אני VV + 2I VH), שבו אני VV ואני <sUB> VH הם עוצמות הקרינה של רכיבים אנכיים ואופקיים, בהתאמה. אנאיזוטרופיה הקרינה רגישה דיפוזיה הסיבוב של fluorophore, כלומר בגודל מולקולרי לכאורה של fluorophore מחובר לחלבון, אשר משתנה על אינטראקציה בין חלבונים. בטקסט הנוכחי, שימוש אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים הודגם להתייחס המחייב בין חלבון מוטצית הסינדרום שווקמן-היהלום (SBDS) לבין גורם ההתארכות כמו-1 GTPase (EFL1). כמקובל, תיוג של חלבון עם fluorophore מתבצעת על קבוצות תיאול (ציסטאין) או בקבוצות אמינו (להלן: אמין או ליזין N-terminal) של החלבון. עם זאת, SBDS בעל מספר cysteines ו lysines שלא איפשר באתר ביים תיוג של זה. כמו טכניקה חלופית, לצבוע 4 ', 5'-bis והעמסה (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) שמשה לתייג מוטיב tetracysteine במיוחד, Cys-Cys-פרו-הגלאי-Cys-Cys, מהונדסים גנטיים C- הסופית של חלבון SBDS רקומביננטי. התאמה של נתוני הניסוי ספקה מידע כמוני ומידע מכניסטית על המצב המחייב בין החלבונים האלה.
Introduction
תאים מכילים שפע של Biomacromolecules המגיבה כל זמן אחד עם השני. קשר זה מעורר מתחמי כי להשתתף מסלולים הסלולר אחראי לתפקוד שלהם הולכת אותות, בקרת גנים ואת נדידת תאים בין היתר. כל האינטראקציות בין החלבונים המתרחשות בתא יוצרי רשת המכונית interactome. בשנת שמר האפייה יותר מ -70% מחלבוני הוכחו יש אינטראקציה 1 שותפים. הבנת interactome של התא ואת תפקידיהם לספק מידע רלוונטי על המורכבות והמגוון של יצורים חיים. מתודולוגיות מספר תוארו לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון-חלבון. שונות גבוהה באמצעות שיטות לשים כגון שני היברידית שמרים 2, מבחני השלמה-מקטעי חלבון 3, טיהור זיקה 4 מצמידים ספקטרומטריית מסה microarra חלבוןys משמש לזהות אינטראקציה 5,6. לאחר הזיהוי, יש צורך לאמת את זה עשוי להשתנות על בסיס כל מקרה לגופו. בדרך כלל, ניסויים אלה כרוכים לשבש את האינטראקציה עצם ברמה של החברים הבודדים של זוג האינטראקציה, למשל, על ידי מחיקת גן או ביטוי יתר של אחד החלבונים, ולאחר מכן מחפשים שינויים במאפיינים או פונקציה של חבר האחר בבית ברמה התאית. בהמשך לכך, טכניקות biophysical 7 משמשות לאפיין את האינטראקציה בין החלבונים ברמה המולקולרית. לשם כך, המבנה של קומפלקסים חלבונים נקבעים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- בעוד calorimetry וספקטרוסקופיה הקרינה משמשים כמותית מכניסטי לתאר אותם.
בעבודה זו, אנאיזוטרופיה הקרינה שמשה כטכניקה לאפיין את האינטראקציה בין EFL1 GTPase ואת SBDחלבון S. חלבונים אלה משתתפים בבניית הסינתזה של הריבוזומים באמצעות קידום שחרורו של גורם ייזום איקריוטיים 6 מפני השטח של 60S 8 למקטע ריבוזומלי. החלבון SBDS עובר מוטציה במחלה המכונה 9 תסמונת שווקמן-יהלום ומעשי כגורם חילופי נוקלאוטיד גואנין עבור EFL1 יורדת הזיקה שלה עבור דיפוספט guanosine 10,11. מוטציות Disease in SBDS לבטל את האינטראקציה עם EFL1 ובכך למנוע הפעלה שלה.
אנאיזוטרופיה הקרינה הוא נפוץ יישומים ביולוגיים ללמוד אינטראקציות חלבון-פפטיד או חומצות גרעין-חלבון. היא מבוססת על העיקרון כי fluorophore נרגש עם תוצאות אור מקוטב פליטת מקוטב חלקית. אנאיזוטרופיה הקרינה מוגדרת על ידי משוואה 1:
איפה אני VV ואני VH הואעוצמות קרינה של אנכי (VV) ואופקי (VH) מקוטבות פליטה כאשר המדגם הוא נרגש עם מקוטב אנכי אור 12. אנאיזוטרופיה הקרינה היא רגישה לגורמים המשפיעים על השער של דיפוזיה הסיבוב של fluorophore ובכך תלויה בטמפרטורה, את הצמיגות של הפתרון ואת הגודל המולקולרי לכאורה של fluorophore. הגודל לכאורה של חלבון המכיל עליות fluorophore כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם חלבון אחר שינוי כזה אז יכול להיות מוערך כשינוי אנאיזוטרופיה. באופן ספציפי יותר, fluorophore שמסתובבת לאט יחסית פתרון לכל חי הניאון שלה תהיה בערך VV אני גדול וערך לי VH קטן ולכן תפגין אנאיזוטרופיה גדול יחסית. עבור fluorophores כי נפילה ביחס במהירות לכל החיים הניאון שלהם, אני VV ואני VH יהיה דומה וערך אנאיזוטרופיה שלהם יהיה קטן 12 </sup > (איור 1). בנוסף, עבור אות אנאיזוטרופיה טובה למדידת רעש, זה הכרחי כדי לקבל fluorophore עם חי שלמי קרינה דומים בפעם מתאם הסיבוב של המולקולה של עניין. אחרת, לא ניתן לרשום את ההבדל במדויק אנאיזוטרופיה בין חלבון חינם וכי במתחם. לדוגמא, אנאיזוטרופיה של בדיקת ניאון עם חיים שלמים קרובים ל -4 NSEC כגון והעמסה או rhodamine מצורפות תרכובת משקל מולקולרית נמוכה של 100 Da היא 0.05. כריכה למולקולה של 160 kDa יגדל ערך אנאיזוטרופיה שלה ל -0.29; הבדל כי ניתן למדוד באופן מדויק. לעומת זאת, באותה הבדיקה הניאון מעורבת תגובה מחייבת גידול אשר בגודל מולקולרי משתנה מ -65 ל 1,000 kDa תגרום רק שינוי אנאיזוטרופיה של 0.28 עד 0.3, שהוא קטן מכדי שיהיה אפשר למדוד במדויק. בתרחיש זה, בדיקה עם חיים שלמים של 400 NSEC תתאים יותר 12.
<p class = "jove_content">
באיור 1. ייצוג סכמטי של ציוד המשמש למדידת אנאיזוטרופיה הקרינה ואת ההליך. ייצוג סכמטי של הציוד המשמש לביצוע אנאיזוטרופיה הקרינה מדידה אינטראקציה בין חלבונים הניסוי. Fluorophores כי נפילת אנאיזוטרופיה קטנה תצוגה מהר המגבירה על קשירת שותף אינטראקציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יישומי קרינה דורשים נוכחות של fluorophore בכל המולקולות למדו. כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון ישנם שלושה סוגי fluorophores: 1) שאריות טריפטופן נוכח החלבונים, 2) fluorophores מצורף כימי 3) שותפי היתוך ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו deriva שלהעזרי למידה. לרובם יש חלבוני שאריות טריפטופן על מבנו, ולכן הדרך הקלה למדוד אינטראקציה היא על ידי מעקב אחר השינויים בספקטרום הקרינה המקביל או על ידי ניטור שינויים בעוצמת הקרינה של שאריות טריפטופן. עם זאת, שאריות טריפטופן עשויות להיות נוכחות בשני החלבונים מסבכים את הניתוח. מצד שני, עבור fluorophore לשינוי תכונות ניאון שלה עקב אינטראקציה זה צריך להיות ממוקם על או ליד אתר הקישור וזה יכול להפריע לאינטראקציה עצמה. זה צריך תשומת לב מיוחדת בעת שימוש fluorophores המגושם כגון GFP. אם אף אחת fluorophores אלה יכולים לשמש למחקרים מחייב יש צורך, אם כן, להציג את fluorophores חיצונית לזו של חלבונים המעורבים. fluorophores רב מסונתזים כימי קיים והוא יכול להיות מחובר קוולנטית חלבונים באמצעות הקבוצות תגובתי שלהם כגון קבוצות האמינות (שרשרת צד של lysines או N- סופי) ואת קבוצות תיאול ב ציסטאין. Fנגזר luorophore עם אסטרים isothiocyanate ו succinimidyl להגיב עם קבוצות אמידות בעוד iodoacetamide ו maleimide קבוצות תיאול-reactive 13. הצבעים הנפוצים ביותר בשימוש ביישומי קרינה הם נגזרים של וההעמסה ואת צבע ירוק rhodamine, coumarins, fluorophores BODIPY וצבעי אלקסה פלואוריד. רשימה מפורטת של fluorophores זמינים מסחרית והשימוש בהם ניתן למצוא אזכור 14,15. עבור תיוג מוצלח, הקבוצה תגובתי חייבת להיחשף על פני השטח של החלבון, אך בשל המספר הגדול של קבוצות פונקציונליות תגובתי בדרך כלל נוכח פוליפפטידים קשה מאוד להשיג שינוי באתר ספציפי. החלבון של עניין במחקר זה, SBDS, מכיל 5 cysteines חינם ו -33 lysines שעלולים לגרום תיוג אתרים מרובים. תיוג לא אחיד עשוי להשפיע על המחייב יסבך ניתוח נתונים כמולקולות fluorophore שונים עשויות לעורר אותות בעצמת ניאון שונים על כריכה. כדי overcome בעיה זו, השתמשנו fluorophore פלאש, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) והעמסת לתווית באתר-ישיר החלבון SBDS. זהו צבע arsenoxide עם זיקה גבוהה במשך ארבע cysteines במרווחים מוטיב יודע כמו פלאש-תג המורכב של רצף CCXXCC כאשר X הוא כל חומצת אמינו מלבד ציסטאין 16,17. מוטיב tetracysteine זה מתווסף N- או C- הסופי של החלבון על ידי הנדסה גנטית יחד עם מקשר נאות כדי למנוע את השיבוש של הקפל הכללי של החלבון. הצמד המורכב לצבוע Flash ו- Flash תג תוכנן במקור לחלבוני תווית ספציפי לאתר בתאים חי 17 אבל זה יכול לשמש גם כדי לתייג חלבונים מטוהרים במבחנה כפי שהוא בא לידי ביטוי כאן. בנוסף, אסטרטגיות האנזימטית גם פותחו כדי לאפשר functionalization ספציפית לאתר של חלבונים 18.
בכתב היד הזה אנו מתארים את השימושיות של אנאיזוטרופיה קרינהכלי sa ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. כריכה ניתן להעריך על ידי בדיקה פשוטה של הצורה העקומה מחייבת בעוד ניתן להשיג מידע כמוני מן ההתאמה של נתוני הניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב הניסויים ביוכימיים עם חלבונים דורשים לא רק חלבון טהור אלא גם כמויות גדולות מהם, ללא קשר הטכניקה המשמשת. מסיבה זו, החלבונים משמשים עבור סוג זה של ניסויים מתקבלים על ידי ביטוי Heterologous, כפי שהיה במקרה המוצג כאן. ספקטרוסקופיה בתפרחת מחייבת הנוכחות של fluorophore במולקולה למ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors acknowledge the financial support from CONACyT project numbers 167359 and 177138, and from DGAPA-UNAM project number IN201615.
Materials
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A., Baldwin, R. L. . Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. , 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. . Principles of fluorescence spectroscopy. , (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L., Gòmez, I. . Tools to understand protein-protein interactions. 37, 1-14 (2012).
- Johnson, I. . The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Sabnis, R. W. . Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W., Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
