Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Summary

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Abstract

Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo essenziale nella funzione di un organismo vivente. Una volta che l'interazione è stata identificata e convalidata è necessario caratterizzare al livello strutturale e meccanicistica. Esistono diversi metodi biochimici e biofisici per tale scopo. Tra questi, anisotropia di fluorescenza è una tecnica potente particolarmente utilizzata quando l'intensità di fluorescenza di una proteina fluoroforo marcato rimane costante mediante interazione proteina-proteina. In questa tecnica, una proteina fluoroforo marcato è eccitato con luce polarizzata verticalmente di opportuna lunghezza d'onda che eccita selettivamente un sottoinsieme dei fluorofori in base al loro orientamento rispetto al fascio in ingresso. L'emissione risultante ha anche una direzionalità cui rapporto in piani verticali e orizzontali definisce anisotropia (r) come segue: r = (I _VV -I _VH) / (I + 2I _{VV VH),} dove _Vv e <sub> VH sono le intensità di fluorescenza dei componenti verticale ed orizzontale, rispettivamente. Anisotropia di fluorescenza è sensibile alla diffusione di rotazione di un fluoroforo, vale a dire la dimensione molecolare apparente di un fluoroforo attaccato ad una proteina, che viene modificato mediante interazione proteina-proteina. Nel testo attuale, l'uso di anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina è stato esemplificato per affrontare il legame tra la proteina mutata nella sindrome del Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento like-1 GTPase (EFL1). Convenzionalmente, l'etichettatura di una proteina con un fluoroforo viene effettuata sui gruppi tiolici (cisteina) o dei gruppi amminici (N-terminali amminici o lisina) della proteina. Tuttavia, SBDS possiede diversi cisteine ​​e lisine che non consentono sito-etichettatura di esso. In una tecnica alternativa, il colorante 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina è stato usato per etichettare specificamente un motivo tetracysteine, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, geneticamente nel C-terminale della proteina ricombinante SBDS. Montaggio dei dati sperimentali fornito informazioni quantitative e meccanicistica della modalità di legame tra queste proteine.

Introduction

Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l'altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell'espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell'interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti ^1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertinenti sulla complessità e la diversità degli organismi viventi. Diverse metodologie sono state descritte per identificare e caratterizzare le interazioni proteina-proteina. Diverso alto attraverso metodi messi come il lievito doppio ibrido ^2, saggi di complementazione proteine frammento ^3, affinità di purificazione ⁴ accoppiata alla spettrometria di massa e microarra proteineys vengono utilizzati per identificare una interazione ^5,6. Una volta identificato, è necessario convalidare e puo variare caso per caso. Tipicamente, questi esperimenti comportano interrompere stessa interazione a livello dei singoli membri della coppia interazione, ad esempio, dalla delezione gene o sovraespressione di una delle proteine, e quindi cerca di cambiamenti nelle proprietà o funzione di un altro membro del livello cellulare. Successivamente, tecniche biofisiche ⁷ sono utilizzati per caratterizzare l'interazione proteina-proteina a livello molecolare. A tal fine, la struttura di complessi proteici sono determinati mediante cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare e la microscopia crioelettronica mentre calorimetria e spettroscopia di fluorescenza sono utilizzati per descriverli quantitativamente e meccanicamente.

In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato come tecnica per caratterizzare l'interazione tra la GTPasi EFL1 e SBDS proteine. Queste proteine partecipano nella sintesi dei ribosomi promuovendo il rilascio di fattore di inizio eucariotico 6 dalla superficie 60S ribosomiale subunità ^8. La proteina SBDS è mutato in una malattia nota come Shwachman-Diamond Sindrome ⁹ e agisce come un fattore di scambio guanina nucleotide per EFL1 diminuendo la sua affinità per guanosindifosfato ^10,11. mutazioni malattia in SBDS abolire l'interazione con EFL1 e quindi impediscono la sua attivazione.

Fluorescenza anisotropia è comunemente usato in applicazioni biologiche per studiare la proteina-peptide o interazioni degli acidi nucleici proteine. Si basa sul principio che un fluoroforo eccitato con risultati luce polarizzata in una emissione parzialmente polarizzata. Anisotropia di fluorescenza è definito dall'equazione 1:

dove ho _vv e mi _VH sono ilintensità di fluorescenza della verticale _(VV) e in orizzontale _(VH) polarizzati emissione quando il campione è eccitato con luce polarizzata verticalmente ^12. Anisotropia di fluorescenza è sensibile a fattori che influenzano la velocità di diffusione rotazionale del fluoroforo e dipende dalla temperatura, la viscosità della soluzione e la dimensione molecolare apparente del fluoroforo così. La dimensione apparente di una proteina contenente un fluoroforo aumenta quando interagisce con un'altra proteina e tale modifica può essere valutato come un cambiamento di anisotropia. Più specificamente, un fluoroforo che ruota lentamente in soluzione rispetto alla sua durata fluorescente avrà un valore I _VV e piccolo valore I _VH e pertanto presentano una relativamente grande anisotropia. Per fluorofori che scendono rapidamente rispetto al loro ciclo di vita fluorescente, ho _Vv e _VH saranno simili e il loro valore anisotropia sarà piccolo ¹² </sup> (Figura 1). Inoltre, per un buon segnale anisotropia di misura del rumore, è necessario avere un fluoroforo con una vita di fluorescenza simile al tempo di correlazione rotazionale della molecola di interesse. Altrimenti, non è possibile registrare accuratamente la differenza di anisotropia tra la proteina libero e che nel complesso. Ad esempio, l'anisotropia di una sonda fluorescente con una durata quasi 4 nsec come fluoresceina o rodamina collegati a un composto a basso peso molecolare di 100 Da è 0.05. Associazione a una molecola di 160 kDa aumenterà il suo valore anisotropia a 0,29; una differenza che può essere misurata con precisione. Al contrario, la stessa sonda fluorescente coinvolto in una reazione di legame cui incremento di peso molecolare varia da 65 a 1000 kDa comporterà solo un cambiamento anisotropia di 0,28 e 0,3, che è troppo piccola per essere misurata con precisione. In questo scenario, una sonda con una durata di 400 nanosecondi sarebbe più adatto ^12.

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Figura 1. Rappresentazione schematica delle apparecchiature utilizzate per misurare anisotropia di fluorescenza e la procedura. Rappresentazione schematica dell'attrezzatura utilizzata per eseguire una anisotropia di fluorescenza misurazione proteina-proteina interazione esperimento. Fluorofori che scendono visualizzazione rapida piccolo anisotropia che aumenta dopo il legame a un partner di interazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

applicazioni fluorescenza richiedono la presenza di un fluoroforo in una qualsiasi delle molecole studiate. Per studiare le interazioni proteina-proteina ci sono tre tipi di fluorofori: 1) i residui di triptofano presenti nelle proteine, 2) fluorofori allegate chimicamente e 3) partner di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua Derivative. La maggior parte delle proteine ​​hanno residui di triptofano sulla sua struttura, così il modo più semplice per misurare un'interazione è monitorando i cambiamenti nel corrispondente spettri di fluorescenza o monitorando i cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei residui di triptofano. Tuttavia, residui di triptofano possono essere presenti in entrambe le proteine ​​complicare l'analisi. D'altra parte, per un fluoroforo per modificare le proprietà fluorescenti dovuto all'interazione deve essere situato sopra o vicino al sito di legame e potrebbe interferire con l'interazione stessa. Questo richiede particolare attenzione quando si utilizza fluorofori ingombranti come GFP. Se nessuno di questi fluorofori può essere utilizzato per studi di legame è necessario, quindi, di introdurre fluorofori estrinseci a una delle proteine ​​coinvolte. Molti fluorofori sintetizzati chimicamente esistono e possono essere covalentemente attaccati alle proteine ​​attraverso i loro gruppi reattivi come i gruppi amminici (catena laterale di lisine o N-terminale) ei gruppi tiolici in cisteina. Fderivati luorophore con isotiocianato e succinimidyl esteri reagiscono con gruppi ammidici mentre Iodoacetamide e maleimmide sono gruppi tiolo-reattivi ^13. I coloranti più comuni utilizzati in applicazioni in fluorescenza sono derivati ​​del fluoresceina ei coloranti verdi rodamina, cumarine, fluorofori BODIPY e coloranti Alexa Fluor. Un elenco dettagliato dei fluorofori disponibili in commercio e il loro uso può essere trovato in riferimenti ^14,15. Per l'etichettatura di successo, il gruppo reattivo deve essere esposto sulla superficie della proteina, ma a causa del gran numero di gruppi funzionali reattivi tipicamente presenti in polipeptidi è molto difficile ottenere modificazioni sito-specifica. La proteina di interesse in questo studio, SBDS, contiene 5 cisteine ​​libere e 33 lisine che possono provocare l'etichettatura più siti. l'etichettatura non uniforme può influenzare il legame e complicherà l'analisi dei dati come diverse molecole fluorofori possono suscitare diversi segnali di intensità fluorescente su vincolante. a Overcome questo problema, abbiamo usato il fluoroforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina all'etichetta sito-diretta la proteina SBDS. Questo è un colorante arsenoxide con alta affinità per quattro cisteine distanziati in un motivo conosciuto come FlAsH-tag costituito dalla CCXXCC sequenza in cui X è un qualsiasi amminoacido diverso cisteina ^16,17. Questo motivo tetracysteine ​​viene aggiunto N- o C-terminale della proteina mediante ingegneria genetica insieme ad un linker opportuno evitare l'interruzione della piega complessiva della proteina. La coppia che consiste di Flash tintura e Flash-tag è stato originariamente progettato per le proteine di etichette site-specific nelle cellule viventi ^17, ma può anche essere usato per etichettare le proteine purificate in vitro come è esemplificato qui. Inoltre, sono stati sviluppati strategie enzimatici per consentire funzionalizzazione site-specific di proteine ^18.

In questo manoscritto descriviamo l'utilità di anisotropia di fluorescenza unTool SA per studiare le interazioni proteina-proteina. Binding può essere valutata semplice ispezione della forma vincolante curva mentre le informazioni quantitative può essere ottenuta dalla misura dei dati sperimentali.

Protocol

1. SBDS-Flash etichetta proteine ​​Espressione e purificazione NOTA: Per gli esperimenti di anisotropia, un flash-tag corrispondente alla sequenza Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys stato aggiunto al C-terminale delle SBDS umani sequenza codificante mediante PCR. Questo costrutto è stato subclonato nel vettore di espressione pRSET-A e trasformato in celle C41 Escherichia coli per esprimere una proteina che codifica per un tag hexahistidine N-terminale (His-tag), i SBDS umani codificante sequenza e un C-terminal…

Representative Results

Per eseguire qualsiasi esperimento anisotropia è importante escludere grandi variazioni dell'intensità di fluorescenza del fluoroforo poiché l'anisotropia osservata di una miscela di specie è rappresentata dall'equazione 5: dove F i rappresenta la fluorescenza frazio…

Discussion

Maggior parte degli esperimenti biochimici con proteine ​​richiedono non solo proteina pura, ma anche grandi quantità di loro, indipendentemente dalla tecnica utilizzata. Per questo motivo, le proteine ​​utilizzate per questo tipo di esperimenti sono ottenuti mediante espressione eterologa, come era il caso qui presentato. spettroscopia Florescence richiede la presenza di un fluoroforo nella molecola studiata. residui aromatici costituiscono i fluorofori intrinseci di una proteina, tuttavia, utilizzando il segn…

Materials

0.5 mm Glass beads	Biospec Products	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Ultra pure
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
dye 4’, 5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein	ThermoFischer Scientific	LC6090	This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous	Formedium	GLU03
D(+)-Galactose	Formedium	GAL03
L-Leucine	Formedium	DOC0157
L-Tryptofan	Formedium	DOC0189
Bezamidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl	Formedium	NAC02	Sodium Chloride
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Magnesium Chloride
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0410
Yeast extract	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Filtration units	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column	QIAGEN	30760	Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell	Hellma Analytics	111-057-40
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Shaker	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Discontinued	FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer	Olis	No applicable	Olis DM 45 with Polarization Toolbox