Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

O recente desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) provou que células somáticas maduras podem voltar a um estado indiferenciado, pluripotentes. Agora, a reprogramação é feito com vários tipos de células somáticas adultas: queratinócitos, células de urina, f ibroblastos, etc. experiências iniciais foram normalmente feito com fibroblastos da derme. No entanto, isto requer um procedimento cirúrgico invasivo para se obter fibroblastos de pacientes. Portanto, as células em suspensão, tais como células de sangue e urina, foram considerados ideais para a reprogramação por causa da conveniência de obtenção de células primárias. Aqui, nós relatamos um protocolo eficiente para a geração de iPSC a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Por plaqueamento das PBMC transduzidas em série para um novo, placa utilizando centrifugação revestido de matriz, este protocolo pode facilmente fornecer colónias IPSC. Este método é também aplicável a células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMCs). Este estudo apresenta um prot simples e eficienteOCOL para a reprogramação de PBMC e CBMCs.

Introduction

As células-tronco têm sido um dos materiais mais atraentes da terapia clínica durante os últimos várias décadas ^1. As propriedades atraentes de células-tronco são pluripotência ea capacidade de auto-renovação. Em 1981, as primeiras células estaminais embrionárias (CES) foram isolados a partir do embrião de rato ^2. No entanto, quando a técnica foi aplicada a embriões humanos, enfrentou vários problemas éticos.

Em 2006, quando o Dr. Yamanaka e sua equipe reprogramou a primeira célula pluripotente a partir de células somáticas de rato, o campo de células-tronco recuperou a sua possibilidade e interesse foi reavivado ^3. Ao entregar vários fatores definidos, as células-tronco pluripotentes foram com sucesso "induzida" a partir de células somáticas adultas, e foram assim chamado "células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)." Em 2007, esta técnica foi aplicada às células humanas ^4, as células com as características exactas do CES rendendo mas nenhum do debate ético. Teoricamente, iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer tipo de célula obtido a partir de um indivíduo ou paciente. iPSCs específicos do paciente estão subindo como uma ferramenta potencial que pode simular os fenótipos da doença e condições epigenéticas de cada paciente individual. Usando edição gene ou outros métodos que podem reverter a condição patogénica, iPSCs específicos do paciente também pode ser usado em medicina personalizada ^5. Além disso, são menos iPSCs associada com a rejeição imunitária porque eles têm a mesma identidade imune como doador, tornando auto-transplante mais viável ^6. Portanto, iPSCs tornaram-se a plataforma mais promissora na modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias regenerativas. Tendo em conta estes benefícios, melhores protocolos que podem dar mais puro e rendimentos mais elevados no menor espaço de tempo a partir da fonte de células menores são constantemente em desenvolvimento. Uma consideração importante de encontrar o protocolo mais eficaz para aplicação no futuro é o tipo de célula primária. A maioria dos primeiros geração proto iPSCcols são otimizados para células aderentes uma vez que as linhas de IPSC originais foram induzidas a partir de fibroblastos da pele ^4. No entanto, o isolamento e a preparação destas células são trabalho intensivo. Além disso, o isolamento de fibroblastos da pele inclui procedimentos cirúrgicos invasivos que podem se tornar uma grande falha de aplicação mais ampla.

Portanto, para a continuação da utilização de iPSCs, uma fonte de células com a aquisição conveniente é necessária. O sangue é considerado como uma fonte de células ideal, uma vez que é obtido através de um procedimento minimamente invasivo, em vez ^{de 7-9.} Neste estudo, foi desenvolvida uma modificação simples de gerar o protocolo hiPSCs de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Sem o difícil processo de expansão de um tipo de células específico, tais como as células CD34 +, células de sangue completo ou PBMC foram serialmente plaqueadas em placas revestidas com matriz por centrifugação após transdução com vírus Sendai contendo factores Yamanaka. Este método reduz o tempo necessário para ofixação de células flutuantes transduzidos e diminuiu a perda de células reprogramadas que não foram capazes de anexar por conta própria.

Protocol

Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). 1. Isolamento de células monocíticas a partir de sangue Isolamento de células monocíticas (dia -5) Obter pelo menos 10 ml de sangue fresco a partir de uma colheita de sangue em um tubo de preparação de células (CPT). Transferir o sangue para um novo tubo cónico de 50 ml e dilui-la com solução salina tamponada com fosfato …

Representative Results

Este protocolo apresenta um método simples para reprogramar CMSPs isolados a partir de sangue. Usando a combinação de chapeamento de série e centrifugação, iPSCs foram geradas com sucesso. Com este método, iPSCs poderia ser gerado com uma pequena quantidade de células de sangue completo, sem isolamento ou a expansão de um tipo de célula específico. Nós com sucesso gerado iPSCs de apenas 1×10 4 células em uma placa de cultura de células pequenas. <p class="jov…

Discussion

Dado que as células estaminais embrionárias (CES) mostrou várias deficiências, foi necessária a necessidade de uma ferramenta alternativa. Portanto, o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por Yamanaka ficou sob os holofotes internacionais. Tem sido quase uma década desde Yamanaka descobriu que pluripotência pode ser induzida pela adição de apenas quatro genes em células somáticas adultas. Desde iPSCs são "induzidos" a partir de células somáticas adultas, eles podem f…

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer