Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Die jüngste Entwicklung der menschlichen induzierten erwies sich pluripotente Stammzellen (hiPSCs), dass reife somatische Zellen zu einem undifferenzierten, pluripotenten Zustand zurückkehren kann. Nun Umprogrammierung ist mit verschiedenen Arten von adulten somatischen Zellen durchgeführt: Keratinozyten, Urin – Zellen, Fibroblasten usw. Frühe Experimente wurden in der Regel mit dermalen Fibroblasten durchgeführt. Jedoch benötigt dies eine invasive chirurgische Verfahren Fibroblasten von Patienten zu erhalten. Daher Suspensionszellen, wie Blut und Urin-Zellen wurden für eine Neuprogrammierung ideal angesehen wegen der Bequemlichkeit die primären Zellen zu erhalten. Hier berichten wir ein effizientes Protokoll zur iPSC Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Durch Plattieren der transduzierten PBMCs seriell zu einer neuen, matrix-beschichtete Platte unter Verwendung von Zentrifugation kann dieses Protokoll leicht iPSC Kolonien bereitzustellen. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC). Diese Studie stellt eine einfache und effiziente ProtOcol für die Reprogrammierung von PBMCs und CBMC.
Introduction
Stammzellen haben in den letzten Jahrzehnten ein in der klinischen Therapie einer der attraktivsten Materialien gewesen. Die attraktiven Eigenschaften von Stammzellen sind pluripotent und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. 1981 wurden die ersten embryonalen Stammzellen ( ES- Zellen) von der Maus – Embryo isoliert 2. Wenn jedoch die Technik, um menschliche Embryonen angewendet wurde, stand es mehreren ethische Fragen.
Im Jahr 2006, als Dr. Yamanaka und sein Team die erste pluripotenten Zelle aus der Maus somatischen Zellen umprogrammiert, wieder die Stammzellfeld seine Möglichkeit und Interesse wurde 3 neu entfacht. Durch die Bereitstellung von mehreren definierten Faktoren waren pluripotente Stammzellen erfolgreich "induziert" aus adulten somatischen Zellen und wurden so genannt "induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen)." Im Jahr 2007 wurde diese Technik auf menschliche Zellen angewendet 4 – Zellen mit den genauen Eigenschaften der WSR aber keiner der ethischen Diskussion ergibt. Theoretisch iPSCs kann aus jedem Individuum oder Patienten erhalten von jedem Zelltyp erzeugt werden. Patientenspezifische iPSCs als potentielles Werkzeug steigen, dass die Krankheit Phänotypen und epigenetische Bedingungen jedes einzelnen Patienten zu simulieren. Mit Gen – Bearbeitung oder andere Methoden , die können umkehren können die pathogenen Zustand, patientenspezifischen iPS auch 5 in der personalisierten Medizin verwendet werden. Außerdem sind iPSCs weniger mit Immunabstoßung verbunden , weil sie dieselbe Immunidentität als Donor haben, so dass die automatische Transplantation führbarer 6. Deshalb haben iPSCs die vielversprechendste Plattform in Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening werden und regenerative Therapien. In Anbetracht dieser Vorteile, verbesserte Protokolle, die reinere und höhere Erträge in der geringsten Menge an Zeit, von der kleinsten Zellquelle geben kann ständig in der Entwicklung. Ein wichtiger Aspekt der effizientesten Protokoll für die künftige Anwendung finden, ist die primäre Zelltyp. Die meisten der frühen iPSC Generation protocols für anhaftenden Zellen optimiert , da die ursprünglichen iPSC Linien von Fibroblasten der Haut 4 induziert wurden. Jedoch sind die Isolierung und Herstellung dieser Zellen arbeitsintensiv. Auch schließt die Isolierung von Haut-Fibroblasten-invasive chirurgische Verfahren, die ein großes Manko für eine breitere Anwendung werden kann.
Daher wird für die weitere Verwendung von iPS-Zellen wird eine Zellquelle mit bequemen Erwerb erforderlich. Blut wird als ideale Zellquelle angesehen , da es durch eine eher minimal – invasive Verfahren 7-9 erhalten wird. In dieser Studie haben wir eine einfache Modifikation des Protokolls hiPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Ohne die schwierige Expansionsprozesses eines bestimmten Zelltyp, wie beispielsweise CD34 + Zellen wurden Vollblutzellen oder PBMCs seriell überzogen auf einer Matrix beschichteten Platten durch Zentrifugation nach der Transduktion mit Sendai-Virus enthält, Yamanaka Faktoren. Dieses Verfahren reduziert die Zeit für die erforderlicheBefestigung von transduzierten schwebenden Zellen und verringert den Verlust von umprogrammiert Zellen, die auf ihren eigenen nicht in der Lage zu befestigen waren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mehrere Mängel zeigte, wurde die Notwendigkeit eines alternativen Werkzeug erforderlich. Daher kam die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka im Rahmen des internationalen Rampenlicht. Es ist schon seit fast einem Jahrzehnt Yamanaka entdeckt, dass Pluripotenz, indem nur vier Gene in adulten somatischen Zellen induziert werden kann. Da iPSCs "induziert" von reifen somatischen Zellen sind, können sie ethische Fragen ausweichen, die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
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