Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero
Summary
Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.
Abstract
I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l’acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell’ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un’analisi enzima-collegata dell’immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L’importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un’analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L’importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l’adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.
Introduction
Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di “sandwich” tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promuovere l’aderenza e interiorizzazione dei patogeni2,4,5. Associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche è mediata da altre proteine attualmente non identificati. Completamente delucidare il ruolo funzionale di Vn-associazione di evasione della risposta immunitaria tubo richiederà pertanto l’identificazione di proteine Vn-recruiting.
Il primo passo nell’identificazione di proteine che legano il Vn è per verificare se un agente patogeno di interesse possibile associare purificata Vn. flusso cytometry è un metodo pratico e semplice per determinare se Vn è associato a patogeni e cellule. In questo studio, abbiamo valutato l’associazione di Vn da vari Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolati clinici6. Il metodo qui descritto è quantitativo e può essere utilizzato per distinguere la capacità di legame di una grande varietà di ceppi batterici. In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la proteina H (PH) di Hif come Vn-legante della proteina7. Di conseguenza, nello studio presente, il potenziale di Vn-associazione dei mutanti di wild type (WT) Hif e Hif M10Δlph sono stati confrontati usando i protocolli descritti.
Una volta che è stato stabilito che un agente patogeno lega Vn, il secondo passo è di caratterizzare il proteoma di superficie al fine di identificare potenziali proteine che legano il Vn. Una varietà di approcci può essere utilizzata per questo scopo8,9, ma queste metodologie non sono descritti in questo rapporto. Il metodo più adatto per l’esame di interazioni proteina-proteina è recombinantly esprimere proteine di superficie batteriche selezionate in e. coli e purificare dalla cromatografia di affinità. Qui, usiamo il PH e la sua interazione molecolare con Vn per illustrare il metodo. Interazioni tra ricombinante PH e Vn sono state caratterizzate utilizzando un enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) l’analisi7 e una tecnica sviluppata di recente privo di etichetta, conosciuta come bio-strato interferometria (BLI)10,11. Mentre Elisa può essere utilizzata per confermare le interazioni proteina-proteina, BLI fornisce dati dettagliati per quanto riguarda i parametri cinetici delle interazioni.
Per studiare il ruolo funzionale di Vn in aderenza batterica, possono essere utilizzati due diversi saggi. Il primo test qui descritto è la misura diretta di aderenza batterica sulle superfici di vetro rivestite con Vn, mentre il secondo saggio esamina l’aderenza alla superficie delle cellule epiteliali. Per il primo test, lastre di vetro sono stati rivestiti con Vn, e l’associazione di WT o ceppi mutanti di Hif è stata valutata da microscopia e colorazione di Gram. Questa tecnica si distingue facilmente batteri basati sulla capacità di associare Vn12. Adesione batterica alle cellule dei mammiferi è stato quindi analizzato aggiungendo batteri coltivati su un monostrato di cellule epiteliali alveolari di II tipo; allegato batterica è stata valutata contando il numero di formazione di colonie (CFUs) unità. Aderito e interiorizzati batteri possono essere distinti in presenza o assenza di Vn4,13.
Il ruolo di acquisizione Vn in resistenza batterica del siero è stato valutato usando un’analisi di uccisione del siero (cioè, l’attività battericida del siero). Per valutare l’importanza di Vn acquisizione nella resistenza del siero, l’attività battericida del siero Vn-vuotati (VDS) è stata confrontata con quella di siero umano normale (NHS). Il metodo utilizzato prontamente distingue Vn-associazione contro batteri vincolanti basati sulla resistenza del siero. Abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo di Vn nella resistenza del siero di diversi batteri patogeni4,12.
Sono stati segnalati numerosi metodi per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Qui, descriviamo una serie di protocolli che possono essere facilmente adattate per lo studio di qualsiasi agente patogeno al fine di valutare il ruolo di Vn nella patogenesi. Abbiamo testato questi protocolli usando vari agenti patogeni, e Hif è stato scelto come esempio per questo report.
Protocol
Representative Results
Discussion
Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all’Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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