Analyser for å studere rollen til Vitronectin i bakteriell vedheft og Serum motstand
Summary
Denne rapporten beskriver protokoller for å karakterisere interaksjoner mellom bakteriell ytre membran proteiner og menneskelige supplement regulator vitronectin. Protokollene kan brukes å studere bindende reaksjoner og biologisk funksjon av vitronectin i en bakterie-art.
Abstract
Bakterier benytte supplement regulatorer som gå utenom vert immunrespons. Her beskriver vi protokoller for å vurdere rollen vitronectin oppkjøpet på bakteriell cellen overflaten skuespill i motstanden mot vert immunsystemet. Flow cytometri eksperimenter identifisert humant plasma vitronectin som en ligand for bakteriell reseptor ytre membran protein H Haemophilus influenzae type f. Enzym knyttet immunosorbent analysen var ansatt å karakterisere protein-protein interaksjoner mellom renset rekombinante proteiner H og vitronectin og bindende affinitet ble vurdert ved hjelp av bio-lag interferometry. Biologiske betydningen av binding av vitronectin protein H på bakteriell celleoverflaten i unndragelse av immunrespons vert ble bekreftet en serum motstand analysen med normal og vitronectin-utarmet humant serum. Betydningen av vitronectin i bakteriell tilslutning ble analysert bruker glass lysbilder med og uten vitronectin belegg, etterfulgt av Gram flekker. Til slutt, bakteriell vedheft til human alveolar epithelial celle monolayers ble undersøkt. Protokollene beskrevet her kan enkelt tilpasses til studiet av en bakterie-art av interesse.
Introduction
Vitronectin (Vn) er en viktig menneskelig glykoprotein involvert i å opprettholde homeostase via regulering av fibrinolytisk. Vn fungerer også som et supplement regulator begrenser terminal komplementbanen under C5b6-7 sammensatt dannelse og C9 polymerisasjon. Flere bakteriell patogener har vist å rekruttere Vn til celleoverflaten som motstå supplement deponering1,2,3. I tillegg fungerer Vn som en “sandwich” molekyl mellom bakterier og vert epithelial celle reseptorene, og dermed fremme overholdelse og internalization patogener2,4,5. Binding av Vn til bakteriell celleoverflaten er formidlet av andre aktuelle uidentifisert proteiner. Klargjørende fullt funksjonell rolle Vn-binding i unndragelse av immunrespons slange vil derfor kreve identifikasjon av Vn-rekruttering proteiner.
Det første trinnet i å identifisere Vn-bindende proteiner er å teste om en patogen rundt kan binde renset Vn. flowcytometri er en praktisk og enkel metode for å avgjøre om Vn er bundet til patogen celler. I denne studien vurdert vi binding av Vn til ulike Haemophilus influenzae type f (Hif) kliniske isolater6. Metoden beskrevet heri er kvantitative og kan brukes til å skille bindende kapasiteten til en rekke bakterielle stammer. I en tidligere studie karakteriserte vi protein H (PH) HIF som en Vn-bindende protein7. Derfor studien, Vn-bindende potensialet av vill-type (WT) Hif og Hif M10Δlph mutanter ble sammenlignet med beskrevet protokollene.
Når det er bestemt at en patogen binder Vn, er det andre trinnet å karakterisere den overflaten proteom for å identifisere potensielle Vn-bindende proteiner. En rekke tilnærminger kan brukes til dette formålet8,9, men disse metodene er ikke beskrevet i denne rapporten. Metoden passer undersøke protein-protein interaksjoner er å recombinantly express valgte bakteriell overflaten proteiner i E. coli og rense ved affinitet kromatografi. Her bruker vi PH og dets molekylær interaksjon med Vn for å illustrere metoden. Interaksjoner mellom rekombinant PH og Vn var preget bruker et enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)7 og en nylig utviklet etikett-fri teknikk kjent som bio-lags interferometry (BLI)10,11. Mens ELISAs kan brukes til å bekrefte protein-protein interaksjoner, gir BLI detaljert data om kinetic parameterne for samhandlinger.
For å studere Vn funksjonelle rolle i bakteriell tilslutning, kan to forskjellige analyser benyttes. Første analysen beskrevet her er direkte måling av bakteriell tilslutning til Vn-belagt glassflater, mens andre analysen undersøker tilslutning til overflaten av epitelceller. Første analysen, glass lysbilder ble belagt med Vn og binding av WT eller mutant Hif stammer ble vurdert av Gram-flekken og mikroskopi. Denne teknikken skiller lett bakterier basert på evnen til å binde Vn12. Bakteriell vedheft til pattedyrceller var da analysert ved å legge kulturperler bakterier på en monolayer av type II alveolar epitelceller; bakteriell vedlegg ble vurdert ved å telle antall colony-forming enheter (CFUs). Overholdt og internalisert bakterier kan skilles i tilstedeværelse eller fravær av Vn4,13.
Rollen Vn oppkjøpet i bakteriell serum motstand ble evaluert med en serum drapet analysen (dvs., serum bakteriedrepende aktivitet). For å vurdere betydningen av Vn oppkjøpet i serum motstand, var bakteriedrepende aktiviteten av Vn-utarmet serum (VDS) forhold til normal humant serum (NHS). Lett metoden skiller Vn-bindende versus ikke-bindende bakterier basert på serum motstand. Vi anvendt denne metoden for å studere rollen til Vn i serum motstanden av flere bakteriell patogener4,12.
Mange metoder er rapportert for å studere vert-patogen interaksjoner. Her beskriver vi et sett med protokoller som kan enkelt tilpasses til studiet av enhver patogen for å vurdere Vn rolle i patogenesen. Vi testet disse protokollene ved hjelp av ulike patogener, og Hif ble valgt som et eksempel for denne rapporten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell patogener rekruttere Vn til celleoverflaten og benytte dette supplement regulator for å hindre avsetning supplement faktorer og ferdigstillelse av membran angrep komplekse2. Vn fungerer også som en bro molekyl mellom bakteriell overflaten proteiner og vert celleoverflaten reseptorer, dermed muliggjør patogener å holde seg til overflaten av epitelceller og senere megle internalisering. I denne studien beskrive vi protokoller som kan brukes til å beregne i) binding av Vn overflaten a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra stiftelsen av Anna og Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. og Edla Johansson Foundation, den svenske Medical Research Council (gi nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Cancer Foundation ved Universitetet Sykehus i Malmø, Physiographical Society (Forssman’s Foundation), og Skåne County Council’s forskning og utvikling Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
