Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro
Summary
Este relatório descreve protocolos para caracterizar as interações entre proteínas de membrana externa bacteriana e a vitronectina regulador do complemento humano. Os protocolos podem ser usados para estudar as reacções de vinculação e função biológica da vitronectina em qualquer espécie bacteriana.
Abstract
As bactérias utilizam reguladores de complemento como um meio de evasão da resposta imune do hospedeiro. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar a aquisição de vitronectina papel em peças de superfície da célula bacteriana em resistência para o sistema imunológico do hospedeiro. Experimentos de citometria de fluxo identificaram vitronectina plasma humano como um ligante para a proteína de membrana externa bacteriana do receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Um ensaio enzima-lig da imunoabsorção foi empregado para caracterizar as interações da proteína-proteína entre proteína recombinante purificada H e vitronectina, e vinculação afinidade foi avaliada usando interferometria de bio-camada. A importância biológica da vinculação da vitronectina a proteína H na superfície da célula bacteriana em evasão da resposta imune do hospedeiro foi confirmada usando um ensaio de resistência de soro com soro humano normal e vitronectina empobrecido. A importância da vitronectina na adesão bacteriana foi analisada usando lâminas de vidro com e sem revestimento vitronectina, seguido de coloração de Gram. Finalmente, a adesão bacteriana em monocamadas de células epiteliais alveolares humana foi investigada. Os protocolos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para o estudo de todas as espécies bacterianas de interesse.
Introduction
Vitronectina (Vn) é uma importante glicoproteína humana envolvido na manutenção da homeostase através de regulamentação do sistema fibrinolítico. Vn também funciona como um regulador de complemento inibindo o caminho de complemento terminal durante a formação do complexo C5b6-7 e polimerização C9. Vários patógenos bacterianos foram mostrados para recrutar Vn à superfície da célula, como um meio de resistir ao complemento deposição1,2,3. Além disso, Vn funciona como uma molécula de “sanduíche” entre bactérias e receptores de células epiteliais anfitrião, assim, promover a adesão e interiorização de patógenos2,4,5. Vinculação de Vn à superfície da célula bacteriana é mediada por outras proteínas atualmente não identificadas. Totalmente elucidar o papel funcional de Vn-ligação na evasão da resposta imune mangueira, portanto, exigirá a identificação das proteínas Vn-recrutamento.
O passo inicial na identificação de proteínas Vn é testar se um patógeno de interesse pode vincular purificada Vn. fluxo cytometry é um método conveniente e simples para determinar se o Vn é vinculado às células do patógeno. Neste estudo, avaliamos a ligação do Vn a vários Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolados clínicos6. O método descrito neste documento é quantitativo e pode ser usado para distinguir a capacidade de ligação de uma grande variedade de estirpes de bactérias. Em um estudo anterior, caracteriza-se proteína H (PH) de Hif como um Vn-ligação proteína7. Portanto, no presente estudo, o potencial de Vn-vinculação de mutantes de tipo selvagem (WT) Hif e Hif M10Δlph foram comparados usando os protocolos descritos.
Assim que for determinado que um patógeno vincula Vn, o segundo passo é caracterizar o proteome superfície a fim de identificar potenciais Vn-proteínas. Uma variedade de abordagens pode ser usada para este propósito8,9, mas essas metodologias não são descritas neste relatório. O método mais apropriado para examinar interações da proteína-proteína é recombinantes expressam proteínas de superfície bacterianas selecionadas em e. coli e purificar por cromatografia de afinidade. Aqui, nós usamos o PH e sua interação molecular com Vn para ilustrar o método. Interações entre recombinante PH e Vn foram caracterizadas usando uma enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)7 e uma técnica livre de etiqueta desenvolvida recentemente conhecido como bio-camada interferometria (BLI)10,11. Considerando que o Elisa pode ser usada para confirmar as interações da proteína-proteína, BLI fornece dados detalhados sobre os parâmetros cinéticos das interações.
Para estudar o papel funcional de Vn na adesão bacteriana, podem ser utilizados dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio descrito aqui é uma medição direta de aderência bacteriana Vn-revestido em superfícies de vidro, Considerando que o segundo ensaio examina aderência à superfície das células epiteliais. Para o primeiro ensaio, lâminas de vidro foram revestidas com Vn, e a ligação do WT ou estirpes mutantes de Hif foi avaliada pela coloração de Gram e microscopia. Esta técnica distingue prontamente bactérias baseadas na capacidade para vincular Vn12. Aderência bacteriana às células dos mamíferos foi então analisada pela adição de bactérias cultivadas em uma monocamada de células alveolares tipo II; fixação bacteriana foi avaliada pela contagem do número de formadoras unidades (CFUs). Bactérias aderidas e interiorizadas podem ser distinguidas na presença ou ausência de Vn4,13.
O papel da aquisição de Vn em resistência bacteriana soro foi avaliado usando um ensaio de matança de soro (ou seja, atividade bactericida do soro). Para avaliar a importância da aquisição de Vn na resistência do soro, a atividade bactericida do soro Vn-esgotada (VDS) foi comparada com o de soro humano normal (NHS). O método usado prontamente distingue Vn-ligação contra bactérias não-vinculativa com base na resistência do soro. Nós usamos este método para estudar o papel do Vn da resistência de soro de vários patógenos bacterianos4,12.
Inúmeros métodos têm sido relatados para estudar interações patógeno-hospedeiro. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos que pode facilmente ser adaptado para o estudo de qualquer agente patogénico a fim de avaliar o papel de Vn na patogênese. Nós testamos estes protocolos utilizando vários patógenos e Hif foi escolhido como um exemplo para este relatório.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patógenos bacterianos recrutam Vn à superfície da célula e utilizam este regulador de complemento para impedir a deposição de factores do complemento e conclusão da membrana ataque complexo2. Vn também funciona como uma molécula de ponte entre proteínas de superfície bacterianas e receptores de superfície celular hospedeiro, permitindo assim a patógenos de aderir à superfície das células epiteliais e posteriormente mediar a internalização. Neste estudo, descrevemos os protocolos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Anna e Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e Edla Johansson Foundation, o sueco Medical Research Council (conceder o número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), a Fundação de câncer da Universidade Hospital em Malmö, a sociedade Physiographical (Fundação do Forssman) e o Conselho de Condado de Skåne pesquisa e Fundação para o desenvolvimento.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
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