Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav & galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd
Summary
Denna rapport beskriver protokoll för kännetecknar interaktioner mellan bakteriell yttre membranproteiner och den mänskliga komplement regulator Aktiebolaget Trav & galopp. Protokollen kan användas för att studera de bindande reaktioner och biologiska funktionen av Aktiebolaget Trav & galopp i någon bakteriearter.
Abstract
Bakterier utnyttjar komplement regulatorer som ett sätt att kringgå värd immunsvaret. Här beskriver vi protokoll för att utvärdera roll Aktiebolaget Trav & galopp förvärvet på bakteriell cell surface lekarna i motstånd mot värd immunsystemet. Flöde flödescytometri experiment som humanplasma Aktiebolaget Trav & galopp en ligand för bakteriell receptor yttre membranprotein H av Haemophilus influenzae typ f. En enzymkopplad immunosorbentanalys var anställd för att karakterisera de protein-protein interaktioner mellan renat rekombinant protein H och Aktiebolaget Trav & galopp och bindande affinitet bedömdes med hjälp av bio-lager interferometri. Den biologiska betydelsen av bindningen av Aktiebolaget Trav & galopp till protein H på bakteriella cellens yta i skatteflykt av värd immunsvar bekräftades med ett serum motstånd i råtthud med normal och Aktiebolaget Trav & galopp-utarmat humanserum. Vikten av Aktiebolaget Trav & galopp i bakteriell vidhäftning analyserades med glasskivor med och utan Aktiebolaget Trav & galopp beläggning, följt av Gramfärgning. Slutligen, bakteriell vidhäftning till mänskliga alveolära epitelceller enskiktslager undersöktes. De protokoll som beskrivs här kan lätt anpassas till studiet av alla bakteriearter sevärdheter.
Introduction
Aktiebolaget Trav & Galopp (Vn) är en viktig mänsklig glykoprotein involverade i att upprätthålla homeostas via reglering av det fibrinolytiska systemet. VN fungerar även som en komplement-regulator genom att hämma den terminal komplementbanan under C5b6-7 komplexa bildande och C9 polymerisation. Flera bakteriella patogener har visat att rekrytera Vn till cellytan som ett sätt att motstå komplement nedfall1,2,3. Dessutom fungerar Vn som en ”smörgås” molekyl mellan bakterier och värd epitelial cellreceptorer, därmed främja följsamhet och internalisering av patogener2,4,5. Bindningen av Vn till bakteriella cellens yta medieras av andra för närvarande oidentifierade proteiner. Fullständigt belysa den funktionella rollen för Vn-bindning i skatteflykt av slang immunsvar kommer därför kräva identifiering av Vn-rekrytera proteiner.
Det första steget i att identifiera Vn-bindande proteiner är att testa om en patogen sevärdheter kan binda renat Vn. flödescytometri är en bekväm och okomplicerad metod för att bestämma huruvida Vn är bunden till patogen celler. I denna studie bedömde vi bindningen av Vn till olika Haemophilus influenzae typ f (Hif) kliniska isolat6. Den metod som beskrivs häri är kvantitativ och kan användas för att skilja den bindande kapaciteten av en mängd olika bakteriestammar. I en tidigare studie karakteriserade vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindande protein7. Därför, i den aktuella studien, Vn-bindande potential av vildtyp (WT) Hif och Hif M10Δlph mutanter jämfördes med protokollen beskrivs.
När det bestäms att en patogen binder Vn, är det andra steget att karakterisera det ytan proteomet för att identifiera potentiella Vn-bindande proteiner. En mängd metoder kan användas för detta ändamål8,9, men dessa metoder beskrivs inte i denna rapport. Metoden som är mest lämpade för att undersöka protein-protein interaktioner är att recombinantly uttrycka valda bakteriella ytproteiner i E. coli och rena genom affinitetskromatografi. Vi använder här, PH och dess molekylär interaktion med Vn för att illustrera metoden. Interaktioner mellan rekombinant PH och Vn präglades med en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 och en nyligen utvecklad etikett-fri teknik som kallas bio-lager interferometry (BLI)10,11. Elisa-test kan användas för att bekräfta protein-protein interaktioner, finns BLI detaljerade uppgifter angående de kinetiska parametrarna av interaktioner.
För att studera den funktionella rollen för Vn i bakteriell vidhäftning, kan två olika analyser utnyttjas. Den första analysen som beskrivs här är direkt mätning av bakteriell adherencen till Vn-belagda glasytor, medan den andra analysen undersöker adherencen till ytan av epitelceller. För första analysen, objektglas var belagda med Vn, och bindningen av WT eller muterade Hif stammar bedömdes genom Gramfärgning och mikroskopi. Denna teknik skiljer lätt bakterier utifrån förmågan att binda Vn12. Bakteriell vidhäftning till däggdjursceller analyserades sedan genom att lägga till odlade bakterier på en enskiktslager av typ II-alveolära epitelceller; bakteriella fastsättning bedömdes genom att räkna antalet kolonibildande enheter (CFUs). Följas och internaliserad bakterier kan urskiljas i närvaro eller frånvaro av Vn4,13.
Rollen av Vn förvärv i bakteriell serum resistens utvärderades med ett serum dödande analys (dvs, serum bakteriedödande aktivitet). För att bedöma betydelsen av Vn förvärv i serum motstånd, var den antibakteriella effekten av Vn-utarmat serum (VDS) jämfört med normala humant serum (NHS). Metoden används lätt skiljer Vn-bindande kontra icke-bindande bakterier baserat på serum motstånd. Vi använde denna metod för att studera rollen som Vn i serum motståndet av flera bakteriella patogener4,12.
Många metoder har rapporterats för att studera värd-patogen interaktioner. Här, beskriver vi en uppsättning protokoll som enkelt kan anpassas till studiet av eventuella patogener för att bedöma Vn roll i patogenesen. Vi testade dessa protokoll som använder olika patogener, och Hif valdes som ett exempel för detta betänkande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriella patogener rekrytera Vn till cellytan och utnyttja detta komplement regulator för att hindra nedfall av komplementfaktorer och slutförandet av membran attack complex2. VN fungerar även som en bro molekyl mellan bakteriella ytproteiner och värd cellreceptorer yta, vilket gör att patogener att följa ytan av epitelceller och därefter medla internalisering. I denna studie beskriver vi protokoll som kan användas för att uppskatta i) bindningen av Vn till ytan av bakterieceller, ii) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från den Foundation i Anna och Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. och Edla Johansson stiftelse, den medicinska forskningsrådet (bevilja nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Stiftelsen Cancer vid universitetet Sjukhuset i Malmö, Fysiografiska samhället (Forssman’s Foundation), och Skåne landstingets forskning och Development Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
