Ihållande Administration av β-cellsmitogener intakt mus cellöar<em> Ex vivo</em> Använda Biodegradable Poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) mikrosfärer
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Utveckling av biomaterial har signifikant ökat potentialen för riktad läkemedelstillförsel till en mängd olika cell- och vävnadstyper, inklusive de pankreatiska p-celler. Dessutom biomaterial partiklar, hydrogeler och ställningar ger också en unik möjlighet att administrera ihållande, till kontrollerbar drug delivery p-celler i odling och i transplanterade vävnadsmodeller. Dessa tekniker tillåter studiet av kandidat β-cellproliferationsfaktorer som använder intakta cellöar och ett translationellt relevant systemet. Dessutom bestämma effektiviteten och genomförbarheten av kandidatfaktorer för att stimulera β-celltillväxt i ett odlingssystem är kritisk innan man går vidare till in vivo-modeller. Häri beskriver vi en metod för att samarbeta kultur intakta mus öar med biologiskt nedbrytbar förening av intresse (COI) -loaded poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (PLGA) mikrosfärer i syfte att bedöma effekterna av ihållande in situ frigöring of mitogena faktorer på β-celltillväxt. Denna teknik beskrivs i detalj hur man skapar PLGA-mikrosfärer innehållande en önskad last användning av kommersiellt tillgängliga reagens. Medan den beskrivna tekniken använder rekombinant human bindvävstillväxtfaktor (rhCTGF) som ett exempel, kan ett brett utbud av COI lätt användas. Dessutom utnyttjar denna metod 96-brunnsplattor för att minimera mängden av reagens som är nödvändiga för att bedöma β-cellproliferation. Detta protokoll kan lätt anpassas för att använda alternativa biomaterial och andra endokrina cellegenskaper såsom cellöverlevnad och differentiering status.
Introduction
Pankreatiska p-celler är de enda insulinproducerande celler i kroppen och är kritiska för att upprätthålla blod glukoshomeostas. Även friska individer har tillräcklig β-cellmassan och fungera för att korrekt reglera blodsockret, är individer med diabetes kännetecknas av otillräcklig β-cellmassan och / eller funktion 1,2. Det har föreslagits att inducera β-cellproliferation i slutändan kan öka β-cellmassan och återställa glukoshomeostas hos individer med diabetes 3. Det krävs dock utvärdering och validering av potentiella β-cellproliferativa föreningar i intakta öar innan effektiva behandlingar kan utvecklas. Transplantation av avlidna mänskliga öar i individer med diabetes åter blod glukoshomeostas under en tid, men tillgången och framgången för detta experimentella förfarande hindras av en brist på mänskliga öar tillgängliga för transplantation och p-celldöd i cellöarna akteruter transplantation 4. Även med upptäckten av faktorer som inducerar förökning av insulinproducerande celler, existerar en stor utmaning fortfarande i att leverera dessa faktorer till relevanta ställen in vivo. En strategi för att ihållande lokal tillförsel av β-cellproliferativa föreningar är poly (mjölk-sam-glykol) syra (PLGA). PLGA har tidigare använts i FDA-godkända drug delivery produkter på grund av sin höga säkerhet, nedbrytbarhet och förlängd frisättning kinetik 5. Specifikt är PLGA en sampolymer av laktid och glykolid som degraderar via hydrolys med vatten, antingen in vivo eller i kultur till mjölksyra och glykolsyra, som är naturligt förekommande metaboliter i kroppen. Den inkapslade läkemedelsföreningen kan frigöras i den omgivande miljön genom både diffusion och / eller nedbrytningskontrollerad frisättningsmekanismer. Inkapsling av COI ger skydd mot enzymatisk nedbrytning, att förbättra biotillgängligheten av reagenset jämfört med unencapsulated COI 5. Vi föreslår att PLGA-mikrosfärer kan användas för att administrera kandidatföreningar till intakta cellöar i kultur, och slutligen in vivo. Testa effekten av PLGA att administrera β-cell mitogener att cellöar ex vivo är kritisk innan transplantationsprotokoll utforskas.
För närvarande finns det ingen teknik för att mäta β-cellproliferation med levande djur. Experiment för att utvärdera effekten av potentiella proliferativa föreningar in vivo kräver därför administrering av dessa föreningar till levande djur, med efterföljande dissekering och bearbetning av pancreata för immunmärkningen. Sådana protokoll är dyra och arbetskrävande, och kräver den förening som skall administreras systemiskt, utan någon garanti för att de kommer att nå cellöarna. Omvänt flera immortaliserade β-cellinjer är tillgängliga för studier av insulinproducerande celler i kultur, men dessa cellinjer saknar den lilla ön arkitektur och environment finns i levande organismer 6. Immortaliserade β-cellinjer är också kännetecknas som att ha en mycket högre grad av replikation än endogena p-celler in vivo, vilket således komplicerar analys av föreningar som inducerar proliferation. I denna studie beskriver vi ett protokoll som använder intakta cellöar isolerade från vuxna möss. Till skillnad från β-cellinjer, intakta cellöar behålla normal holme arkitektur. På samma sätt, i motsats till experiment genomförda in vivo, som administrerar proliferativa föreningar direkt till odlade intakta cellöar signifikant minskar mängden av reagens som är nödvändig för att noggrant mäta β-cellproliferation.
Den aktuella studien använder PLGA att administrera en COI, i detta exempel, rekombinant human bindvävstillväxtfaktor (rhCTGF). Den här beskrivna metoden ger en betydande fördel över administrationen av rå förening till odlade cellöar eftersom det möjliggör en kontinuerlig frisättning av förening i pae media. Notably, kan denna analys modifieras för att administrera en stor mängd proteiner och antikroppar av intresse till intakta cellöar. Effekter på andra endokrina celltyper, inkluderande a-celler, kan också analyseras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien av β-cellproliferation i kultur vanligen hämmas av flera svårigheter. Först odödliggjorda β-cellinjer som kännetecknas av en högre grad av proliferation än vad som finns i endogena p-celler i levande öar. Dessutom är dessa immortaliserade cellinjer saknar den normala arkitekturen kritiska för normal β-cellfunktion. Dessa två faktorer gör det svårt att avgöra om erhållna resultat med odödliggjorda β-cellinjer kommer att hålla sant när den testades in vivo eller i hela öar. Vår bes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
