여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.
서론
췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서
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프로토콜
모든 절차가 승인 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행 하였다.
형광 1. 레이블 COI (선택 사항)
- 미세화물을 시각화와 같은 숙신 이미 딜 에스테르 또는 플루오 레세 인 유도체 (단백질에서 예) 자유 급 아민과 반응하여 형광 염료를 선택. 디메틸 술폭 시드 200 ㎕의 (DMSO)에 형광 물질 (COI의 몰에 대해) 8 배 몰 과량을 녹인다.
- 재현 탁 차량 용액 800 μL의 최종 부피 (62.5 NG / μL의 최종 농도)까지 COI 50mg을. 차량 용액 COI의 소스에 따라 달라진다.
참고 : 일반 차량 솔루션은 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 DMSO를 포함한다. - 단계 1.1에서 형광 / DMSO 용액을 모두 추가하고 COI를 재현 탁. 소용돌이 밤새 4 ° C에서. 대안 적으로, 반응 혼합물에 실온에서 와동4 시간 동안 (RT).
- 라벨 반응에 따라, 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 형광을 제거합니다.
- 탈염 칼럼으로부터 축적 버퍼 드레인 증류수 16 ㎖로 헹군다. 를 통해 모든 흐름을 폐기하십시오.
- 탈염 컬럼에 형광 표지 된 COI를 추가합니다. 탈 이온수 120 ㎖로 용출하....
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결과
도 1은 위의 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 스피어의 시각적 표현이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다양한 크기의 rhCTGF로드 미소를 산출한다. 약간의 미소가 더 큰 (그림 2)있을 수 있지만 마이크로의 가장 큰 부분은 직경이 1 ㎛ 내지 10이됩니다. 원하는 경우, 미세 크기 조정 및 균질화 속도 및 시간, 사용되는 계면 활성제의 농도는, 각각 물 / 오일 / 물 (10)의 상대적인 위상 볼륨으로 제조 파라미터에 기초하여 최적화 될 수있다.
PLGA 미세 및 후속 immunolabeling으로 처리 그대로 섬의 분산에 따라, 세포 (그림 3) 사이에있는 라벨없는 샘플의 영역을 참조하는 것이 일반적입니다. 배양 .......
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토론
문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻은 경우 어려운 결정 할 수 있습니다. 작은 섬 구조가 유지 β 세포 증식이 생체 내에서 발견되는 것과 비교할 바와 같이 갓 절연 그대로 마우스 아일렛을 사용하는 우리의 설명 프로토콜은 이러한 문제를 회피.
그대로 독도를 배양 한 가지 중요한 관심사는 섬 코어 내에서 세포가 저산소증에 의한 괴사를 받게 될 것이다 또는 rhCTGF에 노출되지 않습니다 가능성이다. 이 때문에, 최종0.1 밀리미터 EGTA의 농도는 섬 아키텍처를 방해하지 않고 세포 - 세포 연락처를 풀어.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 이 원고를 비판적으로 읽어준 Bethany Carboneau(밴더빌트 대학교)에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 섬을 분리해 주신 Anastasia Coldren(Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core)과 원심분리기 및 조직 배양 시설을 사용해주신 Alvin C. Powers 박사(밴더빌트 대학 의료 센터)와 David Jacobson 박사(밴더빌트 대학)에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 DK20593의 지원을 받는 밴더빌트 당뇨병 연구 및 교육 센터(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center)의 섬 조달 및 분석 핵심(Islet Procurement and Analysis Core)의 사용과 관련이 있습니다. 이 연구는 R.C.P.에 대한 미국심장협회 박사후 연구원(14POST20380262)의 지원을 받았으며, M.A.G.에 대한 청소년 당뇨병 연구 재단(1-2011-592) 및 재향 군인회(1BX00090-01A1)의 보조금을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | 로 COI 라벨링용 |
| Fisher BioReagents | BP231-1 | 1단계에서 형광단 용해용 | |
| 일회용 PD-10 탈염 컬럼 | GE Healthcare | 17-0851-01 | 1 |
| 단계에서 사용되는 탈염 컬럼Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), 에스테르 말단, 분자량 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | 2단계에서 미세구 생성에 사용 |
| 폴리(비닐 알코올) 분자량 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | 2단계에서 미세구 생성에 사용 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | 무수 포도 |
| 당 배양용 | Fisher BioReagents | 200-075-1 | 섬 매체 보충제 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Sigma-Aldrich | P4333 | 섬 매체용 항생제 |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | 섬 매체 |
| 보충제 96-웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3603 | 섬 |
| 배양용에틸렌 글리코-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',-테트라아세트산 | Sigma-Aldrich | E4378 | 사전 분석 섬 매체용 보충제 |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | 현미경 슬라이드에 세포 회전용 |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | 현미경 슬라이드 |
| 에 세포 회전용에틸렌디아민테트라아세트산 | Fisher BioReagents | BP118-500 | 을 해리하는 데 사용 |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | 세포 고정용 |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | 세포 투과용 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 용 차단 시약 |
| Anti-Ki67 항체 | abcam | ab15580 | Ki67 면역 |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | 인슐린 면역형광 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Ki67 면역형광 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | 인슐린 면역형광 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Aqua-Mount | 의 핵 시각화용Lerner Laboratories | 13800 | 속건성 마운팅 미디어 |
| FreeZone -105 ° C 4.5 리터 캐스케이드 벤치탑 동결 건조 시스템 | Labconco | 7382020 | 미세구의 동결 건조를 위해 |
참고문헌
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R.
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재인쇄 및 허가
