बरकरार माउस आइलेट्स के लिए β-सेल mitogens की निरंतर प्रशासन<em> पूर्व विवो</em> Biodegradable पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) microspheres का उपयोग
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
biomaterials के विकास में काफी सेल और ऊतक प्रकार की एक किस्म के लिए लक्षित दवा वितरण के लिए संभावित वृद्धि हुई है, अग्नाशय β-कोशिकाओं को भी शामिल है। निरंतर प्रशासन के अलावा, biomaterial कणों, हाइड्रोजेल, और scaffolds भी एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं चलाया दवा वितरण बीटा कोशिकाओं को संस्कृति में और प्रतिरोपित ऊतक मॉडल में। इन प्रौद्योगिकियों बरकरार टापू है और एक translationally प्रासंगिक प्रणाली का उपयोग उम्मीदवार β-सेल प्रसार कारकों के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक संस्कृति प्रणाली में β-सेल प्रसार उत्तेजक के लिए प्रभावशीलता और उम्मीदवार कारकों की व्यवहार्यता का निर्धारण करने में विवो मॉडल के लिए आगे बढ़ने से पहले महत्वपूर्ण है। इस के साथ साथ, हम ब्याज की biodegradable यौगिक (COI) -loaded पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) (पीएलजीए) सीटू रिहाई ओ में निरंतर के प्रभाव का आकलन करने के प्रयोजन के लिए microspheres के साथ सह-संस्कृति को बरकरार माउस टापू एक विधि का वर्णनβ-सेल प्रसार पर च mitogenic कारकों। इस तकनीक में विस्तार से वर्णन कैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर एक वांछित माल युक्त पीएलजीए microspheres उत्पन्न करते हैं। जबकि वर्णित तकनीक एक उदाहरण के रूप में पुनः संयोजक मानव संयोजी ऊतक वृद्धि कारक (rhCTGF) का उपयोग करता है, COI की एक विस्तृत विविधता को आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ ही, इस विधि β-सेल प्रसार का आकलन करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा को कम करने के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें का इस्तेमाल करता है। इस प्रोटोकॉल आसानी से वैकल्पिक biomaterials और इस तरह के सेल अस्तित्व और भेदभाव स्थिति के रूप में अन्य अंत: स्रावी सेल विशेषताओं का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
अग्नाशय β-कोशिकाओं को शरीर में केवल इंसुलिन के उत्पादन कोशिकाओं रहे हैं और रक्त ग्लूकोज homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जबकि स्वस्थ व्यक्तियों के लिए पर्याप्त β-कोशिका द्रव्यमान है और ठीक से रक्त ग्लूकोज को विनियमित करने के लिए कार्य करते हैं, मधुमेह के साथ व्यक्तियों अपर्याप्त β-कोशिका द्रव्यमान और / या समारोह 1,2 की विशेषता है। यह प्रस्ताव किया गया है कि β-सेल प्रसार उत्प्रेरण अंततः β-सेल जन बढ़ाने के लिए और मधुमेह के साथ 3 व्यक्तियों में ग्लूकोज homeostasis बहाल कर सकते हैं। हालांकि, मूल्यांकन और बरकरार टापू में संभावित β-सेल proliferative यौगिकों के सत्यापन के लिए आवश्यक से पहले प्रभावी उपचार विकसित किया जा सकता है। मधुमेह के साथ व्यक्तियों में शव का मानव islets के ट्रांसप्लांटेशन कुछ समय के लिए रक्त ग्लूकोज homeostasis पुनर्स्थापित करता है, लेकिन उपलब्धता और इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया की सफलता के पीछे टापू में मानव प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध टापू की कमी से और बीटा कोशिका मृत्यु द्वारा रुकावट हैएर प्रत्यारोपण 4। इससे भी कारक है कि इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं के गुणन को उत्पन्न की खोज के साथ, एक बड़ी चुनौती अभी भी विवो में प्रासंगिक साइटों के लिए इन कारकों पहुंचाने में मौजूद है। β-सेल proliferative यौगिकों के निरंतर स्थानीय वितरण के लिए एक रणनीति पाली (लैक्टिक-सह-glycolic) एसिड (पीएलजीए) है। पीएलजीए एफडीए में उपयोग का एक इतिहास दवा वितरण के उत्पादों को मंजूरी दे दी अपनी उच्च सुरक्षा, biodegradability, और विस्तारित रिलीज कैनेटीक्स 5 के कारण है। विशेष रूप से, पीएलजीए है कि या तो इन विवो में या लैक्टिक एसिड और एसिड है, जो स्वाभाविक रूप से शरीर में उत्पन्न कर रहे हैं चयापचयों में संस्कृति में पानी के साथ हाइड्रोलिसिस के माध्यम से degrades lactide और Glycolide की एक copolymer है। समझाया दवा यौगिक दोनों प्रसार और / या गिरावट नियंत्रित रिलीज तंत्र द्वारा आसपास के वातावरण में जारी किया जा सकता है। COI के encapsulation, एंजाइमी गिरावट के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है अभिकर्मक के जैव उपलब्धता में सुधार unencapsula की तुलनाटेड COI 5। हमारा सुझाव है कि पीएलजीए microspheres और संस्कृति में बरकरार टापू को उम्मीदवार यौगिकों प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विवो में अंततः। पीएलजीए की प्रभावकारिता परीक्षण islets के लिए पूर्व vivo β-सेल mitogens प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल पता लगाया जाता है से पहले है।
वर्तमान में, वहाँ जीवित पशुओं में β-सेल प्रसार को मापने के लिए कोई तकनीक है। प्रयोगों विवो में संभावित proliferative यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इसलिए immunolabeling के लिए बाद में विच्छेदन और Pancreata के प्रसंस्करण के साथ, जानवरों के रहने के लिए इन यौगिकों के प्रशासन की आवश्यकता है। ऐसे प्रोटोकॉल महंगी और श्रमसाध्य हैं, और परिसर की आवश्यकता होती है किसी भी गारंटी नहीं है कि वे टापू तक पहुंच जाएगा, बिना प्रणालीबद्ध प्रशासित किया जाना है। इसके विपरीत, कई अमर β-सेल लाइनों संस्कृति में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन इन सेल लाइनों आइलेट वास्तुकला और पर्यावरण की कमीटी जीवों 6 रह में पाया। अमर β-सेल लाइनों भी विवो में अंतर्जात β-कोशिकाओं की तुलना में नकल का एक बहुत उच्च डिग्री होने के लिए, इस प्रकार यौगिकों कि प्रसरण का विश्लेषण उलझी रूप में होती हैं। इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल वयस्क चूहों से अलग बरकरार टापू का उपयोग करता है का वर्णन है। β-सेल लाइनों के विपरीत, अक्षत टापू सामान्य आइलेट वास्तुकला बरकरार रहती है। इसी तरह, विवो में किए गए प्रयोगों, सीधे सुसंस्कृत बरकरार टापू को proliferative यौगिकों के प्रशासन के विपरीत काफी अभिकर्मकों की मात्रा सही β-सेल प्रसार को मापने के लिए आवश्यक है कि कम करता है।
वर्तमान अध्ययन में इस उदाहरण में, एक COI प्रशासन के लिए पीएलजीए का इस्तेमाल करता है, पुनः संयोजक मानव संयोजी ऊतक विकास फैक्टर (rhCTGF)। विधि यहाँ वर्णित सुसंस्कृत टापू के लिए कच्चे परिसर के प्रशासन पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान के रूप में यह वीं में परिसर के एक निरंतर जारी करने के लिए अनुमति देता हैई मीडिया। विशेष रूप से, इस परख प्रोटीन और बरकरार टापू के हित के लिए एंटीबॉडी की एक विस्तृत विविधता प्रशासन के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रभाव α-कोशिकाओं सहित अन्य अंत: स्रावी प्रकार की कोशिकाओं पर भी विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति में β-सेल प्रसार के अध्ययन के लिए आम तौर पर कई कठिनाइयों आड़े आती है। सबसे पहले, अमर β-सेल लाइनों क्या लाइव टापू में अंतर्जात β-कोशिकाओं में पाया जाता है की तुलना में प्रसार के उच्च डिग्री की विश?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
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