Vedvarende Administrasjon av β-celle mitogener å Intakte Muse holmer<em> Ex Vivo</em> Ved hjelp av biologisk nedbrytbart Poly (melkesyre-ko-glykolsyre) Mikrokuler
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Utviklingen av biomaterialer har økt betydelig potensial for målrettet medikamentavlevering til en rekke celletyper og vev, inkludert de pankreatiske p-celler. I tillegg biomateriale partikler, hydrogeler og stillasene gir også en unik mulighet til å administrere vedvarende, til kontroller levering av legemidler p-celler i kultur og transplanterte vevet modeller. Disse teknologiene tillater studiet av kandidaten β-celle spredning faktorer ved hjelp av intakte holmer og en translatorisk relevant system. Videre bestemmelse av effektiviteten og gjennomførbarheten av kandidat faktorer for å stimulere β-celleproliferasjon i et kultursystem er kritisk før fremover til in vivo-modeller. Heri beskriver vi en fremgangsmåte for å ko-kultur intakte øyer mus med biologisk nedbrytbart forbindelsen av interesse (COI) -loaded poly (melke-ko-glykolsyre) (PLGA) mikrosfærer for det formål å vurdere virkningene av vedvarende frigivelse in situ of mitogene faktorer på β-celleproliferasjon. Denne teknikken beskriver i detalj hvordan å generere PLGA mikrosfærer som inneholder en ønsket last ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser. Mens den beskrevne teknikken bruker rekombinant human Bindevev vekstfaktor (rhCTGF) som et eksempel, kan et bredt spekter av Coi lett anvendes. I tillegg gir denne fremgangsmåten anvender 96-brønners plater for å minimalisere mengden av reagenser som er nødvendig for å vurdere β-celleproliferasjon. Denne protokollen kan lett tilpasses for å benytte alternative biomaterialer og andre endokrine cellekarakteristikker slik som celleoverlevelse og differensiering status.
Introduction
Pankreatiske p-celler er de eneste insulinproduserende celler i kroppen, og er kritisk for å opprettholde blodglukose homeostase. Mens friske mennesker har tilstrekkelig β-cellemasse og funksjon for å regulere blodsukkeret, er personer med diabetes preget av utilstrekkelig β-cellemasse og / eller funksjon 1,2. Det er blitt foreslått å indusere β-celleproliferasjon kan til slutt øke β-cellemasse og gjenopprette glukosehomeostase i individer med diabetes 3. Imidlertid er evaluering og validering av potensielle β-celle proliferative forbindelser i intakte holmer nødvendig før effektive behandlingsformer kan utvikles. Transplantasjon av avdød menneskelige holmer i personer med diabetes gjenoppretter blodsukker homeostase i noen tid, men tilgjengeligheten og suksessen til denne eksperimentelle prosedyren er hindret av mangel på menneskelige holmer tilgjengelig for transplantasjon og ved p-celledød i holmer akterer transplantasjon 4. Selv med oppdagelsen av faktorer som induserer formering av insulinproduserende celler, eksisterer det en stor utfordring fortsatt i å levere disse faktorene til relevante områder in vivo. En strategi for vedvarende lokal levering av β-celle-proliferative forbindelser som er poly (melkesyre-ko-glykol) syre (PLGA). PLGA har en historie med bruk i FDA godkjente stoffet levering produkter på grunn av sin høye sikkerhet, nedbrytbarhet, og forlenget frigjøring kinetikk 5. Nærmere bestemt er PLGA en kopolymer av laktid og glykolid som degraderer via hydrolyse med vann, enten in vivo eller i kultur til melkesyre og glykolsyre, som er naturlig forekommende metabolitter i kroppen. Den innkapslede medikamentforbindelse kan frigjøres i omgivelsene både diffusjon og / eller nedbrytningsstyrt utløsermekanisme. Innkapsling av COI gir beskyttelse mot enzymatisk nedbrytning, noe som forbedrer biotilgjengeligheten av reagenset i forhold til unencapsulated COI 5. Vi foreslår at PLGA mikrosfærer kan anvendes for å administrere kandidatforbindelser til intakte holmer i kultur, og til slutt in vivo. Teste effekten av PLGA å administrere β-celle mitogener til holmer ex vivo er kritisk før transplantasjon protokoller er utforsket.
For tiden er det ingen teknikk for å måle β-celleproliferasjon i levende dyr. Eksperimenter for å vurdere effektiviteten til potensielle proliferative forbindelser in vivo krever derfor at administrering av disse forbindelsene til levende dyr, med etterfølgende disseksjon og prosessering av pankreata for immunolabeling. Slike protokoller er kostbare og arbeidskrevende, og krever at den forbindelse som skal administreres systemisk, uten noen garanti for at de vil nå holmene. Omvendt, flere udødeliggjorte β-cellelinjer er tilgjengelige for studiet av insulinproduserende celler i kultur, men disse cellelinjene mangler holmen arkitektur og miljøvennt funnet i levende organismer 6. Udødeliggjorte β-cellelinjer er også karakterisert ved å ha et mye høyere grad av replikasjon enn endogene P-celler in vivo, og således kompliserer analyse av forbindelser som induserer proliferasjon. I denne studien beskriver vi en protokoll som bruker intakte holmer isolert fra voksne mus. I motsetning til β-cellelinjer, intakte øyer beholde normal holme arkitektur. På samme måte, i motsetning til eksperimenter utført in vivo, administrering av proliferative forbindelser direkte til dyrkede intakte øyer reduserer mengden av reagenser som er nødvendig for å nøyaktig måle β-celleproliferasjon betydelig.
Studien anvender PLGA å administrere en COI, i dette eksempel, rekombinant, humant Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF). Metoden er beskrevet her overfører en betydelig fordel i forhold til forvaltning av rå forbindelsen til dyrkede holmer som gjør det mulig for en kontinuerlig frigjøring av forbindelsen til the medier. Spesielt, kan denne analysen modifiseres for å administrere et bredt utvalg av proteiner og antistoffer av interesse å intakte øyer. Effekter på andre endokrine celletyper, inkludert a-celler, kan også bli analysert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet av β-celleproliferasjon i kultur blir vanligvis hemmet av en rekke vanskeligheter. Først blir udødeliggjorte β-cellelinjer, karakterisert ved høyere grad av spredning enn det som er funnet i endogene P-celler i levende øyer. I tillegg er disse udødeliggjorte cellelinjer som mangler den vanlige arkitekturen kritisk for normal β-cellefunksjon. Disse to fakta gjør det vanskelig å avgjøre om resultatene oppnådd ved bruk av udødelig β-cellelinjer vil holde sant når testet in vivo eller i hele …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
