脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法
Summary
脂質は細胞機能に重要な役割を果たしていることが知られています。ここでは、好中球細胞外トラップ形成の基礎となるメカニズムのより良い理解を得るために、HPTLC及びHPLCの両方を使用することにより、コレステロールレベルに重点を置いて、好中球の脂質組成を決定するための方法について説明します。
Abstract
高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）によって実行される脂質分析は、脂質の広い範囲を分析する比較的単純な、費用対効果の高い方法です。 （宿主-病原体相互作用またはホストエントリで、例えば ）脂質の機能は、細胞プロセスに重要な役割を果たしていることが報告されています。ここで、我々は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と比較してHPTLCによる一次血液由来の好中球のコレステロールレベルを中心とし、脂質組成を決定するための方法を示します。目的は、好中球細胞外トラップ（のNET）の形成における脂質/コレステロールの変化の役割を調査することでした。 NETのリリースは、ホスト内の広がりから病原体を防ぐために、ホストの防御機構として知られています。したがって、血液由来のヒト好中球は、細胞中の脂質変化を誘導するメチルβシクロデキストリン（MβCD）で処理しました。 HPTLC及びHPLCを使用して、我々は、細胞のMβCD処置は脂質につながることが示されています細胞のコレステロール含有量の大幅な削減に関連付けられている変更。免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、同時に、好中球のMβCD処置は、ネットの形成につながりました。要約すると、ここでは、脂質の好中球の変化や網の形成を研究するための詳細な方法を提示します。
Introduction
脂質は、細胞の恒常性、細胞死、宿主-病原体相互作用、およびサイトカイン放出1に重要な役割を果たしていることが示されています。時間が経つにつれて、細胞応答では、特に、ステロイドコレステロールを宿主 – 病原体相互作用または炎症中の脂質の影響に関するについて関心と知識が増加している、といくつかの出版物は、特定の脂質の中心的役割を確認します。 3-ヒドロキシ-3-メチル – 補酵素-Aレダクターゼ（HMG-CoAの還元）を遮断することによってコレステロール生合成の阻害剤として使用されるスタチン、と薬理学的治療は、インターロイキンの血清レベルを低下させることによって抗炎症剤として作用することができます6およびC反応性タンパク質2。コレステロール及びスフィンゴ糖脂質に富む構造は、ホスト3、4、5へのゲートウェイとして、そのような細菌やウイルスなどのいくつかの病原体で使用することができますクラス= "外部参照"> 6。スフィンゴ脂質（ 例えば、スフィンゴミエリン）は、その病原7を促進するために病原体によって使用されることが示されています。細胞を入力するためのマクロファージにおける、マイコバクテリアの使用コレステロールに富むドメイン。コレステロールの枯渇は、マイコバクテリアの取り込み8を阻害します。さらに、（また、ウサギ熱としても知られる）、 野兎病菌、野兎病の原因で人畜共通感染剤9とマクロファージの感染は、コレステロールは、膜10から除去されたときに廃止された感染症につながりました。同様に、脂質リッチ構造を介して大腸菌による宿主細胞の浸潤は、コレステロール依存4であることが実証されました。また、上皮細胞のネズミチフス菌感染実験は、コレステロールを細胞11への病原体の進入のために必須であることを実証しました。コレステロール枯渇inhibiteサルモネラ11のD摂取。さらに、Gilk らによる最近の研究。コレステロールはコクシエラのburnetti 12の取り込みに重要な役割を果たしていることを実証しました。また、トゥオンら 。 25-ヒドロキシコレステロールは、リポ多糖（LPS）による食作用において重要な役割を果たしていることが見出されたマクロファージを刺激さ13。マクロファージは、薬理学的コレステロール14を枯渇させる処理した場合、食作用が低下しました。したがって、コレステロールおよび他の脂質は、彼らの枯渇は、いくつかの病原体10、11、12からの侵入の危険性を減らすことができるため、感染症や炎症に重要な役割を果たしているようです。
最近、我々は脂質の変化、細胞からのコレステロールの特に枯渇は、好中球extracellulaの形成を誘導することを示すことができましたヒト血液由来の好中球15のRトラップ（のNET）。 2004年のNETの発見以来、彼らは細菌の取り込みに重要な役割を果たしていることが示され、これにより感染16、17の広がりを妨げるでてきました。ネットは、ヒストン、プロテアーゼ、及び抗菌ペプチド16に関連付けられているDNA骨格から成ります。好中球によるのNETの放出は、病原体18,19及びホルボールミリステートアセテート（PMA）またはスタチン16、20などの化学物質の侵入によって誘導することができます。しかし、詳細な細胞メカニズム、特にこの過程における脂質の役割は、まだ完全には明らかではありません。脂質の分析は、このようなのNETのリリースなどの細胞プロセスとの相互作用の多種多様に関与するメカニズムのより良い理解につながることができます。 CholesteROLとスフィンゴミエリンは、彼らが、安定性を追加し、タンパク質輸送およびイベント21のシグナル伝達に関与するタンパク質のクラスタリングを促進する細胞膜と脂質マイクロドメインの重要な構成要素です。このような環状オリゴ糖のメチルβシクロデキストリン（MβCD）などの特定の脂質、両親媒性の薬剤、の機構的役割を調べるために、細胞の脂質組成を変化させるためにインビトロ 15 中のコレステロールを減少させるために使用することができます。ここでは、MβCDに応じて、好中球の脂質組成を分析するためにHPTLCを使用する方法を提示します。 HPLCは、好中球集団でのコレステロールのレベルを確認するために使用されました。さらに、我々は、MβCDに応答してヒト血液由来の好中球に免疫蛍光顕微鏡によってのNETの形成を視覚化する方法を記載します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、HPTLCによってコレステロール、又はHPLCのような特定の脂質を分析すると（ノイマンら15参照 ）のNETの形成に対する薬理脂質変化の効果を調べるために使用することができます。
HPTLCは、多数のサンプル中の脂質の広い範囲を分析するため、比較的費用効果がありかつ簡単な方法です。この方法は、上皮細胞における抗生?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アカデミーのfürTiergesundheit（AFT）の交わりとアリアンノイマンに与えられる大学獣医学部の、ハノーバー、ドイツの博士課程、「動物と人獣共通感染症」からフェローシップによってサポートされていました。
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
