विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन
Summary
लिपिड सेलुलर कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। यहाँ, हम न्यूट्रोफिल के लिपिड संरचना निर्धारित करने के लिए, कोलेस्ट्रॉल स्तर पर जोर देने के साथ, न्युट्रोफिल कोशिकी जाल गठन के अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए दोनों HPTLC और एचपीएलसी का उपयोग करके एक विधि का वर्णन।
Abstract
उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (HPTLC) द्वारा किया जाता लिपिड विश्लेषण लिपिड की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण करने की एक अपेक्षाकृत सरल, लागत प्रभावी तरीका है। लिपिड (जैसे, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत या मेजबान प्रविष्टि में) के समारोह कोशिकीय प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है। यहाँ, हम लिपिड रचना निर्धारित करने के लिए, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) की तुलना में प्राथमिक रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल की कोलेस्ट्रॉल के स्तर, HPTLC द्वारा पर ध्यान देने के साथ एक विधि दिखा। उद्देश्य न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) के गठन में लिपिड / कोलेस्ट्रॉल परिवर्तन की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। नेट रिहाई मेजबान के भीतर फैलने से रोगाणुओं को रोकने के लिए एक मेजबान के सुरक्षा तंत्र के रूप में जाना जाता है। इसलिए, रक्त व्युत्पन्न मानव neutrophils कोशिकाओं में लिपिड परिवर्तन प्रेरित करने के लिए मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) के साथ इलाज किया गया। HPTLC और एचपीएलसी का उपयोग करना, हम पता चला है कि कोशिकाओं के MβCD उपचार लिपिड की ओर जाता हैसेल की कोलेस्ट्रॉल सामग्री में उल्लेखनीय कमी के साथ जुड़े परिवर्तन। इसी समय, न्यूट्रोफिल की MβCD उपचार के रूप में immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है, जाल के गठन के लिए नेतृत्व। संक्षेप में, यहाँ हम न्यूट्रोफिल में लिपिड परिवर्तन और जाल के गठन का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
लिपिड सेल homeostasis, कोशिका मृत्यु, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और साइटोकाइन रिहाई 1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है। समय के साथ, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत या सूजन में लिपिड के प्रभाव पर के लिए ब्याज और ज्ञान में वृद्धि हुई है, और कई प्रकाशनों सेलुलर प्रतिक्रिया में कुछ लिपिडों की केंद्रीय भूमिका, विशेष रूप से स्टेरॉयड कोलेस्ट्रॉल, की पुष्टि करें। स्टैटिन, जो अवरुद्ध 3-हाइड्रोक्सी-3-methylglutaryl-coenzym-ए-रिडक्टेस द्वारा कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण के अवरोधकों के रूप में उपयोग किया जाता है के साथ औषधीय उपचार (HMG-CoA-रिडक्टेस), इंटरल्यूकिन के सीरम स्तर को कम करके के रूप में विरोधी भड़काऊ एजेंट कार्य कर सकते हैं 6 और सी-रिएक्टिव प्रोटीन 2। कोलेस्ट्रॉल और glycosphingolipid-समृद्ध संरचनाओं इस तरह के बैक्टीरिया और वायरस के रूप में कई रोगाणुओं द्वारा, मेजबान 3, 4, 5 में एक प्रवेश द्वार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकतावर्ग = "xref"> 6। Sphingolipids (जैसे, sphingomyelin) दिखाया गया है रोगजनकों द्वारा प्रयोग की जाने वाली उनकी pathogenicity 7 बढ़ावा देने के लिए। मैक्रोफेज में, माइक्रोबैक्टीरिया उपयोग कोलेस्ट्रॉल समृद्ध कोशिकाओं में प्रवेश के लिए डोमेन; कोलेस्ट्रॉल की कमी माइकोबैक्टीरियल तेज 8 को रोकता है। इसके अलावा, Francisella tularensis, एक जूनोटिक एजेंट Tularemia के लिए जिम्मेदार है (यह भी खरगोश बुखार के रूप में जाना जाता है) 9, साथ मैक्रोफेज के संक्रमण एक संक्रमण है कि जब कोलेस्ट्रॉल झिल्ली 10 से समाप्त हो गया था समाप्त कर दिया गया का नेतृत्व किया। इसी तरह, लिपिड युक्त संरचनाओं के माध्यम से कोलाई द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण कोलेस्ट्रॉल पर निर्भर 4 होने के लिए प्रदर्शित किया गया। इसके अलावा, साल्मोनेला उपकला कोशिकाओं से typhimurium संक्रमण प्रयोगों प्रदर्शन किया है कि कोलेस्ट्रॉल कोशिकाओं 11 में रोगज़नक़ प्रवेश के लिए आवश्यक है। कोलेस्ट्रॉल कमी inhibiteघ साल्मोनेला 11 की तेज। इसके अलावा, Gilk एट अल द्वारा हाल के एक अध्ययन। दिखा दिया है कि कोलेस्ट्रॉल Coxiella burnetti 12 की तेज करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। साथ ही, Tuong एट अल। पाया गया कि 25-hydroxycholesterol lipopolysaccharide (LPS) द्वारा phagocytosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता मैक्रोफेज 13 -stimulated। Phagocytosis कम हो गया था जब मैक्रोफेज औषधीय कोलेस्ट्रॉल 14 व्यय करने के लिए इलाज किया गया। इस प्रकार, कोलेस्ट्रॉल और अन्य लिपिड, संक्रमण और सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए के बाद से उनकी कमी कई रोगजनकों 10, 11, 12 से आक्रमण के खतरे को कम कर सकते हैं लगता है।
हाल ही में, हम, कि लिपिड परिवर्तन, सेल से कोलेस्ट्रॉल का विशेष रूप से कमी दिखाने न्युट्रोफिल extracellula के गठन के लिए प्रेरित करने में सक्षम थेआर जाल (नेट) मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल 15 में। 2004 में जाल के खोज के बाद से वे इस तरह संक्रमण की 16, 17 के प्रसार में बाधा उत्पन्न में बैक्टीरिया फंसाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाया गया है, और। जाल हिस्टोन, proteases, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 16 के साथ जुड़े एक डीएनए रीढ़ की हड्डी से मिलकर बनता है। न्यूट्रोफिल द्वारा जाल के रिलीज रोगजनकों 18, 19 और रासायनिक पदार्थों ऐसे phorbol-myristate-एसीटेट (PMA) या 16 स्टैटिन, 20 के रूप में हमलावर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। हालांकि, विस्तृत सेलुलर तंत्र, और इस प्रक्रिया में लिपिड के विशेष रूप से भूमिका है, अभी भी नहीं पूरी तरह से स्पष्ट कर रहे हैं। लिपिड के विश्लेषण इस तरह के जाल के रिलीज के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं और बातचीत, की एक विस्तृत विविधता में शामिल तंत्र का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। CholesteROL और sphingomyelin कोशिका झिल्ली और लिपिड microdomains, जहां वे स्थिरता जोड़ सकते हैं और प्रोटीन की तस्करी और घटनाओं 21 संकेत में प्रोटीन शामिल क्लस्टरिंग की सुविधा के महत्वपूर्ण घटक हैं। इस तरह के चक्रीय oligosaccharide मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) के रूप में कुछ लिपिड, amphiphilic औषधीय एजेंटों, की यंत्रवत भूमिका की जांच करने के लिए, एक सेल के लिपिड संरचना को बदलने के लिए और इन विट्रो 15 में कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम HPTLC उपयोग करने के लिए MβCD के जवाब में न्यूट्रोफिल के लिपिड संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। एचपीएलसी न्युट्रोफिल आबादी में कोलेस्ट्रॉल के स्तर पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, हम MβCD के जवाब में मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल में immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मच्छरदानी का गठन कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
(देखें न्यूमन एट अल। 15) यहाँ वर्णित विधियों ऐसे कोलेस्ट्रॉल के रूप में विशिष्ट लिपिड, HPTLC या HPLC द्वारा, विश्लेषण करने के लिए और जाल के गठन पर औषधीय लिपिड परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए इस्ते?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के एरियन न्यूमन के लिए प्रदान की पशु चिकित्सा, हनोवर, जर्मनी के विश्वविद्यालय, के Akademie फर Tiergesundheit (पीछे) और पीएचडी कार्यक्रम, से एक फैलोशिप के एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया "पशु और जूनोटिक संक्रमण,"।
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
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