Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas
Summary
Los lípidos se sabe que juegan un papel importante en las funciones celulares. A continuación, describimos un método para determinar la composición lipídica de los neutrófilos, con énfasis en el nivel de colesterol, mediante el uso de ambos HPTLC y HPLC para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la formación trampa extracelular de neutrófilos.
Abstract
Análisis de lípidos realizado por cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) es un método relativamente simple y rentable de análisis de una amplia gama de lípidos. La función de los lípidos (por ejemplo, en las interacciones huésped-patógeno o entrada de host) se ha informado a desempeñar un papel crucial en los procesos celulares. Aquí, se muestra un método para determinar la composición de los lípidos, con un enfoque en el nivel de colesterol de neutrófilos derivados de la sangre primarias, por HPTLC en comparación con la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El objetivo fue investigar el papel de las alteraciones de lípidos / colesterol en la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). liberación NET se conoce como un mecanismo de defensa del huésped para evitar la propagación de patógenos dentro del huésped. Por lo tanto, los neutrófilos humanos derivados de la sangre se trataron con metil-β-ciclodextrina (MβCD) para inducir alteraciones lipídicas en las células. Usando HPTLC y HPLC, hemos demostrado que el tratamiento MβCD de las células conduce a lípidosalteraciones asociadas con una reducción significativa en el contenido de colesterol de la célula. Al mismo tiempo, el tratamiento MβCD de los neutrófilos condujo a la formación de los TNE, como se muestra por microscopía de inmunofluorescencia. En resumen, aquí presentamos un método detallado para estudiar alteraciones lipídicas en los neutrófilos y la formación de los TNE.
Introduction
Los lípidos han sido demostrado que desempeñan papeles importantes en la homeostasis celular, la muerte celular, las interacciones huésped-patógeno, y la liberación de citoquinas 1. Con el tiempo, el interés y el conocimiento sobre el impacto de los lípidos en interacciones huésped-patógeno o la inflamación se han incrementado, y varias publicaciones confirmar el papel central de ciertos lípidos, especialmente el colesterol esteroide, en las respuestas celulares. El tratamiento farmacológico con estatinas, que se utilizan como inhibidores de la biosíntesis del colesterol mediante el bloqueo de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-reductasa (HMG-CoA-reductasa), puede actuar como agentes anti-inflamatorios mediante la reducción de los niveles séricos de interleucina 6 y la proteína C-reactiva 2. Colesterol y estructuras de glicoesfingolípidos enriquecido puede ser utilizado por varios patógenos, tales como bacterias y virus, tal como una puerta de entrada en el huésped 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Los esfingolípidos (por ejemplo, esfingomielina) se han mostrado para ser utilizados por patógenos para promover su patogenicidad 7. En los macrófagos, el uso de micobacterias dominios para entrar en las células enriquecida en colesterol; un agotamiento de colesterol inhibe la captación micobacteriana 8. Además, la infección de macrófagos con Francisella tularensis, un agente zoonótica responsable de la tularemia (también conocida como fiebre del conejo) 9, condujo a una infección que fue abolida cuando el colesterol se agotó de las membranas 10. Del mismo modo, la invasión de las células huésped por Escherichia coli a través de estructuras ricas en lípidos se demostró que el colesterol dependiente 4. Además, Salmonella typhimurium experimentos de infección de las células epiteliales demostraron que el colesterol es esencial para la entrada de patógenos en las células 11. El colesterol agotamiento inhiben estad la absorción de Salmonella 11. Además, un estudio reciente de Gilk et al. demostró que el colesterol juega un papel importante en la absorción de Coxiella burnetii 12. Además, Tuong et al. encontró que el 25-hidroxicolesterol juega un papel crucial en la fagocitosis por lipopolisacárido (LPS) estimulada por los macrófagos 13. La fagocitosis se redujo cuando los macrófagos fueron tratados farmacológicamente para agotar colesterol 14. Por lo tanto, el colesterol y otros lípidos parecen jugar un papel importante en la infección y la inflamación, ya que su agotamiento puede reducir el riesgo de invasión de varios patógenos 10, 11, 12.
Recientemente, hemos sido capaces de demostrar que las alteraciones lipídicas, especialmente el agotamiento de colesterol a partir de la célula, inducir la formación de extracellula neutrófilostrampas r (TNE) en neutrófilos derivados de sangre humana 15. Desde el descubrimiento de los TNE en 2004, que se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en el atrapamiento bacteriana, y por lo tanto en obstaculizar la propagación de la infección 16, 17. TNE consisten en una cadena principal de ADN asociado con histonas, proteasas, y péptidos antimicrobianos 16. La liberación de las redes por los neutrófilos puede ser inducida por patógenos invasores 18, 19 y sustancias químicas tales como de forbol-miristato-acetato (PMA) o estatinas 16, 20. Sin embargo, los mecanismos celulares detalladas, y especialmente el papel de los lípidos en este proceso, aún no están totalmente claras. El análisis de los lípidos puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos implicados en una amplia variedad de procesos y las interacciones celulares, tales como la liberación de TNE. CholesteLOD y esfingomielina son constituyentes esenciales de la membrana celular y lípidos microdominios, donde se añaden estabilidad y facilitan el agrupamiento de las proteínas implicadas en el tráfico de proteínas y eventos 21 de señalización. Para investigar el papel mecanicista de ciertos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tales como el oligosacárido cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), se puede utilizar para alterar la composición lipídica de una célula y para reducir el colesterol in vitro 15. A continuación, presentamos un método para utilizar HPTLC para analizar la composición de lípidos de los neutrófilos en respuesta a MβCD. HPLC se utilizó para confirmar el nivel de colesterol en la población de neutrófilos. Además, se describe un método para visualizar la formación de los TNE por microscopía de inmunofluorescencia en los neutrófilos derivados de sangre humana en respuesta a MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí se pueden utilizar para analizar los lípidos específicos, tales como colesterol, por HPTLC o HPLC y para investigar los efectos de alteraciones lipídicas farmacológicos sobre la formación de redes (ver Neumann et al. 15).
HPTLC es un método relativamente rentable y simple para analizar una amplia gama de lípidos en un gran número de muestras. Este método se ha utilizado en muchas áreas de investigación, incluyendo la cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Akademie für Tiergesundheit (AFT) y una beca del programa de doctorado, "Animal y zoonóticas infecciones", de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania, proporcionado a Ariane Neumann.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
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