Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Circadian Uhren sind funktional in allen lichtempfindlichen Organismen, so dass eine Anpassung an die Außenwelt durch tägliche Umweltveränderungen antizipieren. Erhebliche Fortschritte in unserem Verständnis der engen Verbindung zwischen der inneren Uhr und die meisten Aspekte der Physiologie wurde auf dem Gebiet in den letzten zehn Jahren gemacht. Um jedoch die molekulare Basis zu entwirren, die beim Menschen bleibt der höchste technische Herausforderung, die Funktion des zirkadianen Oszillators zugrunde liegt. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines experimentellen Ansatzes für die langfristige (2-5 Tage) Biolumineszenz Aufnahme und Abfluss Medium Sammlung in kultivierten menschlichen Primärzellen. Zu diesem Zweck haben wir Primärzellen mit einem lentiviralen Luciferase-Reporter transduziert, die unter der Kontrolle eines Kerntakt Genpromotor ist, der für die Beurteilung der parallel Hormonsekretion und circadian Biolumineszenz ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Bedingungen für die in pr die innere Uhr zu störenimary menschlichen Zellen durch Transfektion von siRNA Targeting CLOCK. Unsere Ergebnisse auf der zirkadianen Regulation der Insulinsekretion durch menschliche Pankreasinseln und Myokine Sekretion durch humane Skelettmuskelzellen, werden hier vorgestellt, um die Anwendung dieser Methodik zu veranschaulichen. Diese Einstellungen können verwendet werden, um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren zu studieren und ihre funktionellen Auswirkungen auf primäre Zellen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu analysieren.
Introduction
Die zirkadiane Zeitsystem (aus dem Lateinischen "Circa diem") hat sich in allen lichtempfindlichen Organismen, als ein adaptiver Mechanismus zur Rotation der Erde entstanden. Bei Säugetieren wird sie in einer hierarchischen Weise organisiert, die zentrale Uhr umfasst, die in den suprachiasmatischen Kern des Hypothalamus ventral liegt und peripheren (oder Slave) Oszillatoren, die in verschiedenen Organen wirksam sind. Außerdem sind funktionelle diese Zelle autonom selbsterhaltende Oszillatoren in fast jeder Zelle des Körpers 1. Photic Signale stellen eine dominante Synchron Cue (Zeitgeber) für die SCN – Neuronen, während neuronale und humorale Signale von der SCN die peripheren Uhren zurückgesetzt ausgeht. Zusätzlich Rest-Aktivitätsrhythmen, die wiederum Fütterung-Fasten – Zyklen fahren, sind weitere Synchronisierungen für periphere Uhren 2. Nach unserem derzeitigen Verständnis wird die molekulare Zusammensetzung des Kerntakt basiert auf der Transkription und Übersettionalen Rückkopplungsschleifen, die zwischen den Organismen konserviert sind. Dies umfasst die Transkriptionsaktivatoren BMAL1 und CLOCK, die zusammen die Transkription der negativen Gene Kerntakt PER und CRY aktivieren. Hohe Konzentrationen von PER und CRY Proteine ihre eigene Transkription durch Hemmung des BMAL1 / CLOCK Komplexes hemmen. Eine Hilfsschleife besteht aus den Kernrezeptoren REV-ERBs und RORs, der auch die Transkription von BMAL1 und CLOCK regulieren. Darüber hinaus repräsentieren posttranslationale Ereignisse , einschließlich Phosphorylierung, sumoylation, Acetylierung, O-GlcNAcylierung, Abbau und Kern Eintritt der Kerntakt Proteine eine zusätzliche wichtige regulatorische Schicht bei der Festlegung der 24 – Stunden – Schwingungszyklus 3.
Thesaurierend Beweis stammt aus Studien in Tiermodellen und unterstreicht die entscheidende Rolle des zirkadianen Systems bei der Koordination von metabolischen und endokrinen Funktionen 4-5. Eine Anzahl von largE-Skala vorschlagen Transkriptom – Analyse , dass Fütterung – Nüchtern – Zyklen 6-8 eine zentrale Rolle bei der Synchronisation der peripheren Oszillatoren spielen. In einer Vereinbarung mit diesen Studien, Metabolom und lipidomic Analyse bei Nagern und Menschen haben gezeigt , dass eine große Anzahl von Metaboliten im Gewebe schwingen, Plasma und Speichel in einem zirkadianen Weise 9-11. Wichtig ist , zeigen die meisten Hormone zirkadianen Rhythmen im Blut 5,12-13. Darüber hinaus Zirkadianrhythmen des entsprechenden Hormons peripheren Gewebe produzieren könnte Hormonsekretion lokal regulieren. Zellautonome zirkadianen Oszillatoren wurden in Nagetieren und menschlichen Pankreas – Inselzellen 14-16 beschrieben. Diese Oszillatoren spielen eine wesentliche Rolle in der Pankreas – Insel Transkriptom Regulierung und Funktion 15,17-18. Weiterhin wurde Myokine Sekretion durch menschliche Skelett Myotuben kürzlich eine zirkadiane Muster aufweisen gezeigt, die durch zellautonomen oscillato geregeltrs operative in diesen Zellen 19.
Verschiedene Ansätze wurden für die weithin in vivo beim Menschen zirkadianen Rhythmen zu studieren. Zum Beispiel Plasma Melatonin oder sowie Brust-Hautoberflächentemperatur ( zusammengefasst in Referenzen 3,20) Cortisolspiegel wurden endogene zirkadiane Uhren zu bewerten untersucht. Obwohl diese Verfahren die systemische circadian Oszillationen in vivo erlauben , zu studieren, sind sie weit eine zuverlässige Beurteilung der Freilauf autonomen zirkadianen Rhythmen in verschiedenen Organen und Geweben von der Bereitstellung. Dennoch würde eine solche Präparation aus dem systemischen Regulation ein unverzichtbares Werkzeug für das Verständnis der spezifischen Wirkung der intrazellulären molekularen Uhren auf die Funktion dieser Zellen. Daher ist eine erhebliche Anstrengungen unternommen worden , zuverlässige Ansätze zur Untersuchung der menschlichen Uhren in immortalisierten oder primären kultivierten Zellen in vitro synchronisiert zu entwickeln , durchgeführt. Wichtig ist, wurde gezeigt, dassTakteigenschaften gemessen in kultivierten primären Haut – Fibroblasten – Zellen reflektieren eng die einzelnen Takteigenschaften des gesamten Organismus 21. Die Entwicklung von fluoreszierenden und Biolumineszenz circadian Reporter hat diesen Ansatz 22-27 stark vorangetrieben . Weiterhin Studium primären Zell Uhren , die von verschiedenen peripheren Organen ableiten ermöglicht die Untersuchung der molekularen Eigenschaften von menschlichem Gewebe-spezifischen Takte 3,5,16,19-20,28. Somit Beurteilung der inneren Uhren in in vitro synchronisiert primäre Explantate oder Zellen, durch Biolumineszenz Reporter Verwendung stellt eine sehr nützliche Methode , um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren und ihre Auswirkungen auf die Organfunktion zu untersuchen.
In diesem Artikel werden wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der zirkadianen Genexpression in primären menschlichen Inselchen und Skelettmuskelzellen in vitro synchronisiert präsentieren sowie die Auswirkungen der autonomen Zell UhrStörungen auf der sekretorischen Funktion dieser Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die experimentellen hier beschriebenen Einstellungen bestehen aus lentiviralen Lieferung von circadian Biolumineszenz Reporter in kultivierten humanen primären Zellen, gefolgt von der anschließenden in vitro – Synchronisation und eine kontinuierliche Aufzeichnung der Biolumineszenz für mehrere Tage, und die parallele Analyse von Hormonsekretion durch die gleichen Zellen. Sie stellen einen effizienten Ansatz für molekulare Mechanismen und funktionelle Aspekte der zirkadianen Uhren in primären menschlichen Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Kollegen von der Universität Genf: Jacques Philippe für konstruktive Kommentare zu dieser Arbeit, Ueli Schibler für wertvolle Hilfe bei der Entwicklung des Perifusion System und für die wissenschaftliche Inspiration, André Liani für das Design konzipiert haben, Fertigung und Inbetriebnahme von das Perfusionssystem, Lesa-Technologie LTD Unternehmen für die Unterstützung bei der Perifusion System und Drip-biolumicorder Software-Entwicklung, George Severi für die Unterstützung bei den Perifusion Experimenten Ursula Loizides-Mangold zum Lesen kritisch das Manuskript, und Anne-Marie Makhlouf für Lentiviren Vorbereitungen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon und Hubert Vidal (INSERM, Lyon) für die menschliche primäre Myoblasten vorzubereiten; und Domenico Bosco und Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Universitätsspital Genf) für die menschliche Inseln bieten. Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen National Science Foundation Grant No finanziert 31003A_146475 / 1, die Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt-Stiftung, Stiftung Ernst et Lucie Schmidheiny, und Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
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