מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
שעוני יממה הם פונקציונליים בכל היצורים רגישים לאור, המאפשרים עיבוד לעולם החיצוני על ידי צופה שינויים סביבתיים יומיים. התקדמות ניכרה בהבנת הקשר ההדוק בין השעון הביולוגי ואת רוב ההיבטים של פיזיולוגיה נעשתה בתחום בעשור האחרון. עם זאת, לחשיפת הבסיס המולקולרי העומד בבסיס הפונקציה של מתנד היממה בבני אדם נשאר של האתגר הגבוה ביותר טכנית. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של גישה ניסויית לטווח ארוך (2-5 ימים) הקלטת פליטת אור ואיסוף בינוני יצוא ב תאים ראשוניים אדם מתורבתים. לשם כך, יש לנו transduced תאים ראשוניים עם כתב בלוציפראז lentiviral כי הוא תחת שליטה של מקדם גן שעון ליבה, אשר מאפשר הערכה במקבילה של הפרשת הורמון פליטת אור יממה. יתר על כן, אנו מתארים את התנאים לשבש את השעון הביולוגי בתחום יחסי הציבורתאים אנושיים imary ידי transfecting CLOCK מיקוד siRNA. התוצאות שלנו על תקנת היממה של הפרשת אינסולין על ידי איי לבלב אנושיים, ואת הפרשת myokine ידי תאי שריר שלד אנושיים, מובאות כאן כדי להדגים את יישום מתודולוגיה זו. הגדרות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם כדי לנתח את השפעת הפעילות שלהן על תאים ראשוניים בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological.
Introduction
מערכת תזמון היממה (מלטינית "Circa דיאם") התפתחה בכל היצורים הרגישים לאור, כמו מנגנון הסתגלות לכיוון הסיבוב העצמי של כדור הארץ. ביונקים, היא מאורגנת באופן היררכי, המקיפה את השעון המרכזי, אשר ממוקם בגרעין suprachiasmatic של ההיפותלמוס הגחון, ואת פריפריה (או עבדים) מתנדים כי הם פעילים באיברים שונים. יתר על כן, מתנדים העצמיים מתמשך אוטונומית תאים אלה הם פונקציונליים כמעט בכל תא בגוף 1. אותות photic לייצג אות סינכרון דומיננטי (צייטגבר) עבור נוירונים SCN, ואילו אותות עצביים הלחות הנפלט SCN לאפס את השעונים ההיקפיים. במקצבים שאר-פעילות בנוסף, שמניעים במחזורי האכלה-צום בתורם, הם synchronizers נוסף על שעונים היקפיים 2. לפי ההבנה הנוכחית שלנו, את האיפור המולקולרי של שעון הליבה מבוסס על תעתיק ו Translaלולאות משוב תזונתיות, אשר שמורות בין אורגניזמים. מהווה את activators תעתיק BMAL1 ושעון, אשר יחד להפעיל שעתוק של גני PER ולבכות שעון ליבה השליליים. רמות גבוהות של PER וחלבוני CRY תמנענה שעתוק שלהם באמצעות עיכוב של מתחם BMAL1 / שעון. בלופ עזר מורכב של קולטנים הגרעיניים REV-ERBs ו RORs, אשר גם לווסת את השעתוק של BMAL1 ושעון. יתר על כן, אירועי posttranslational כוללים זירחון, sumoylation, acetylation, O-GlcNAcylation, שפלה וכניסת גרעין של חלבוני שעון הליבה מייצגים שכבה רגולטוריות חשובה נוספת בביסוס מחזור התנודה 24 שעות 3.
ראיות מצטברות נובעות ממחקרים במודלים של מכרסמים ומדגישות את התפקיד הקריטי של מערכת היממה בתיאום פונקציות מטבוליות האנדוקרינית 4-5. מספר largדואר בקנה מידה ניתוח transcriptome עולה כי האכלה – צום מחזורים לשחק תפקיד מרכזי הסנכרון של מתנדים היקפי 6-8. בהסכם עם המחקרים הללו, metabolomic וניתוח lipidomic במכרסמים ובבני אדם חשפו כי מספר רב של מטבוליטים להתנדנד ברקמות, פלזמה, ורוק באופן היממה 9-11. חשוב לציין, רוב ההורמונים להפגין מקצבי היממה בדם 5,12-13. יתר על כן, שעוני יממה של ההורמון המקביל בייצור רקמות היקפיות עשויים לווסת הפרשת הורמון מקומי. תאים אוטונומיים מתנדים יממה תוארו מכרסם ותאי לבלב אנושיים 14-16. מתנדים אלה ממלאים תפקיד חיוני בוויסות transcriptome לבלב ולתפקד 15,17-18. יתר על כן, הפרשת myokine ידי myotubes השלד האנושי הודגמה לאחרונה להציג דפוס היממה, אשר מווסתת על ידי oscillato תאים אוטונומייםrs פעיל בתאים אלה 19.
מספר גישות ללימוד מקצבי יממה בבני האדם in vivo היו בשימוש נרחב. למשל, מלטונין פלזמה או רמות קורטיזול וכן טמפרטורת פני עור החזי (הנסקרת ב אזכור 3,20) נחקר להעריך שעוני יממה אנדוגני. למרות ששיטות אלו מאפשרות ללמוד תנודות יממה מערכתיות in vivo, הם רחוקים מלהיות מספקים הערכה אמינה של מקצבי יממה אוטונומיים חופשיים פועלים באיברים וברקמות שונים. אף על פי כן, דיסקציה כזה מן הרגולציה המערכתית תהיה כלי חיוני להבנת ההשפעה הספציפית של שעון מולקולרי תאי על תפקודם של תאים אלה. לכן, במאמץ ניכר, שבו בוצע עד לפתח גישות אמינות לחקר שעוני אדם תאים בתרבית הנציחו או עיקריים המסונכרנים במבחנה. חשוב לציין, זה הוכח כימאפייני שעון נמדדים תאי פיברובלסטים עור בתרבית ראשוניים מקרוב לשקף את מאפייני שעון הפרט של האורגניזם כולו 21. התפתחות כתבי יממת פלורסנט bioluminescent מאוד התקדמה גישה זו 22-27. יתר על כן, שעוני תא ראשוניים לומדים כי נגזרים איברים היקפיים שונים מאפשרים חקירת התכונות המולקולריות של שעוני רקמות ספציפיות אדם 3,5,16,19-20,28. לפיכך, הערכת שעוני יממת explants הראשוני במבחנה מסונכרנת או תאים, באמצעות כתבי bioluminescent, מייצג שיטה שימושית מאוד ללמוד את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם והשפיעו על תפקוד איברים.
במאמר זה, נציג פרוטוקולים מפורטים להערכת ביטוי גני יממה בתאי איון עיקרי אדם שריר השלד מסונכרן במבחנה, כמו גם את ההשפעה של שעון סלולארי אוטונומיהפרעה על תפקוד הפרשה של תאים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההגדרות ניסיון המתואר כאן מורכבות משלוח lentiviral של כתבי פליטת אור יממה לתוך תאים ראשוניים אדם מתורבתים, ואחריו הסנכרון הבא במבחנת הקלטה רציפה של פליטת אור במשך כמה ימים, וניתוח מקביל של הפרשת הורמון ידי אותם תאים. הם מייצגים גישה יעילה עבור חקר מנגנונים מולקולריי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים עמיתינו מאוניברסיטת ז'נבה: ז'אק פיליפ עבור הערות בונות על עבודה זו, Ueli Schibler לעזרה יסולא בפז עם התפתחות מערכת perifusion ועבור השראה מדעית, אנדרה ליאני עבור לאחר יזום תכנון, ייצור וביצוע של מערכת זלוף, Lesa-טכנולוגיה בע"מ החברה על הסיוע במערכת perifusion לטפטף-biolumicorder פיתוח תוכנה, ג'ורג Severi לסיוע עם הניסויים perifusion, אורסולה Loizides-מנגולד לקריאת כתב היד באופן ביקורתי, ואן-מארי מכלוף להכנות lentivirus ; אטיין Lefai, סטפני Chanon ויוברט וידאל (INSERM, ליון) להכנת myoblasts העיקרי האדם; וכדי דומניקו בוסקו והתיירים Berney (מרכז השתלות איילט אדם, בית החולים האוניברסיטאי ז'נבה) למתן איי אדם. עבודה זו מומנה על ידי מס 'גרנט השוויצרי הקרן הלאומית למדע 31003A_146475 / 1, Sinergia השוויצרי הקרן הלאומית למדע מענק מס 'CRSII3-154405, romande Fondation לשפוך Diabete sur la משוכלל ונדיר, בו Hjelt קרן, et Fondation ארנסט לוסי Schmidheiny, וסוסייטה Académique דה ז'נב (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
