Summary

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Published: November 11, 2016
doi:

Summary

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Abstract

概日時計は、毎日の環境の変化を先取りすることにより、外部世界への適応を可能にする、すべての光に敏感な生物において機能的です。概日時計と生理学の多くの側面の間の緊密な接続の我々の理解にかなりの進歩は、過去10年間分野で行われています。しかし、ヒトにおける概日振動の機能の根底にある分子基盤を解明することは、最高の技術的な課題のままです。ここでは、培養ヒト初代細胞における長期(2-5日)生物発光記録及び流出媒体のコレクションのための実験的アプローチの詳細な説明を提供します。この目的のために、我々は、ホルモン分泌および概日生物発光の並列評価を可能にするコアクロック遺伝子プロモーターの制御下にあるレンチウイルスルシフェラーゼレポーターで初代細胞を形質導入しています。さらに、我々は広報で体内時計を破壊するための条件を記述するCLOCKを標的とする siRNAをトランスフェクトすることにより、imaryヒト細胞。ヒト骨格筋細胞によるヒト膵島によるインスリン分泌のサーカディアン規制、myokine分泌に対する我々の結果は、この方法論の適用を示すために、ここで提示されています。これらの設定は、ヒト末梢時計の分子構成を研究するために生理学的または病態生理学的条件下での初代細胞に対するそれらの機能的な影響を分析するために使用することができます。

Introduction

ラテン語「サーカ日当」から概日タイミングシステムは、地球の回転に適応機構として、すべての光に敏感な生物で浮上しています。哺乳類では、腹側視床下部の視交叉上核に位置する中央クロックを、包含する、階層的に組織化され、周辺装置(またはスレーブ)異なる器官で動作する発振器。また、これらの細胞自律的な自己持続発振器は本体1のほぼすべての細胞において機能的です。 SCNから発せられる神経および体液性信号が末梢時計をリセットするのに対し、透光層の信号は、SCNニューロンのための支配的な同期キュー(Zeitgeber)を表します。ターン送り絶食サイクルで駆動するほかレスト-活性リズムでは、周辺クロック2のためにさらにシンクロナイザです。私たちの現在の理解によれば、コアクロックの分子メイクアップは、転写およびtranslaに基づいています生物間で保存されている的なフィードバックループ、。これは、一緒に負のコアクロックPERCRY遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子BMAL1とCLOCKを備えます。 PERとCRYタンパク質の高レベルは、BMAL1 / CLOCK複合体の阻害を介して自分の転写を阻害します。補助ループはまた、BMAL1CLOCKの転写を調節する核内受容体REV-ERBSとRORS、から構成されています。さらに、リン酸化、SUMO化、アセチル化などの翻訳後のイベントは、O-GlcNAc化、劣化及びコアクロックタンパク質の核エントリは、24時間の発振周期3を確立する上で追加の重要な調節層を表します。

蓄積証拠は齧歯類モデルにおける研究から茎および代謝および内分泌機能4-5の連携における概日システムの重要な役割を強調しています。ラーグの数電子スケールのトランスクリプトーム解析給餌することを示唆している-断食サイクルは、周辺の発振器6-8の同期で中心的な役割を果たしています。これらの研究と一致して、げっ歯類およびヒトにおけるメタボロームとlipidomic分析は、代謝物の多くは概日様式9-11に組織、血漿、唾液で発振することを明らかにしました。重要なことは、ほとんどのホルモンは血液5,12-13に概日リズムを示します。また、末梢組織の生産に対応するホルモンの概日時計は、局所的にホルモンの分泌を調節する可能性があります。細胞自律的概日発振器は、げっ歯類とヒトの膵島細胞14-16に記載されています。これらの発振器は、膵島トランスクリプトームと機能15,17-18の調節において重要な役割を果たしています。さらに、ヒト骨格筋管によってmyokine分泌は、最近、細胞自律oscillatoによって調節される概日パターンを示すことが実証されていますこれらの細胞19で動作するRS。

インビボでのヒトにおける概日リズムを研究するためのいくつかの手法が広く用いられています。例えば、プラズマメラトニンまたはコルチゾールレベルだけでなく、(参考文献3,20に見直さ)胸部皮膚表面温度は、内因性の概日時計を評価するために研究されてきました。これらの方法は、in vivoで全身概日振動を勉強できますが、彼らははるかに異なる器官および組織におけるフリーランニング自律概日リズムの信頼性の評価を提供するからです。それにもかかわらず、全身の規制から、このような解剖は、これらの細胞の機能に細胞内の分子時計の具体的な効果を理解するために不可欠なツールとなります。したがって、かなりの努力がin vitroで同期不死化または初代培養細胞でヒトクロックを研究するための信頼性のあるアプローチを開発するために行われています。重要なことはことが実証されています初代培養皮膚線維芽細胞で測定されたクロックの特性は密接に生物全体21の個々のクロック特性を反映しています。蛍光および生物発光概日レポーターの開発が大幅にこのアプローチ22-27を進んでいます。さらに、異なる末梢器官に由来している勉強の初代細胞クロックはヒト組織特異的なクロック3,5,16,19-20,28の分子特性の調査を可能にします。このように、in vitroでの同期の一次外植片または細胞内での概日時計の評価は、生物発光レポーターを使用することにより、分子ヒト末梢時計のメイクや臓器の機能に及ぼす影響を研究するための非常に有用な方法を表しています。

本稿では、自律的な細胞クロックの影響だけでなく、in vitroで同期ヒト初代膵島および骨格筋細胞内の概日遺伝子発現を評価するための詳細なプロトコルを紹介しますこれらの細胞の分泌機能に関する混乱。

Protocol

倫理の声明:このプロトコルに含まれる操作は、ジュネーブ大学病院の倫理委員会および倫理委員会SUD EST IV(契約111分の12)19によって承認されました。参考文献16,18で私たちによって記述、または商業的供給源から得られるヒト膵島は、ジュネーブ(スイス)の大学病院での膵島移植センターで脳死多臓器ドナーの膵臓から単離しました。 初代培養細胞?…

Representative Results

浴液洗浄ヒト膵島細胞からのパラレルサーカディアン生物発光の記録と膵島ホルモン分泌の評価概日時計の最初の分子特性を提供した後、ヒトの膵島細胞16内の作動は、我々は、膵島機能と転写18上のクロックの混乱の影響を研究することを目的としました。私たちは、CLOCK mRNAの80%以上のノックダ?…

Discussion

ここで説明する実験的な設定は、その後のin vitroでの同期や数日間の生物発光の連続記録、および同細胞によるホルモン分泌の平行分析に続いて、培養されたヒト初代細胞への概日生物発光レポーターのレンチウイルスデリバリーで構成されています。彼らは、ヒト初代細胞内で分子機構と概日時計の機能的な側面を探索するための効率的なアプローチを表します。

<p class="jove_conten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、ジュネーブ大学からの私達の同僚に感謝しています:ジャック・フィリップこの作業に関する建設的なコメントのために、Ueli Schibler灌流システムの開発で、科学のインスピレーションのための貴重な助けのための、設計、製造、試運転の考案したためアンドレLianiレンチウイルス調製物のための批判的に原稿を読み取るための灌流実験の支援のために潅流システム、灌流システムとドリップbiolumicorderソフトウェア開発の支援のためのレサ・テクノロジー株式会社の会社、ジョージセベーリ、ウルスラLoizides-マンゴールド、アン・マリーMakhlouf ;エティエンヌLefai、ステファニーChanonヒューバート・ヴィダル(INSERM、リヨン)へのヒト一次筋芽細胞を調製します。そして、ドメニコ・ボスコとティエリー・バーニー(ヒト膵島移植センター、ジュネーブ大学病院)へのヒト膵島を提供します。この作品は、スイス国立科学財団助成金番号31003A_146475 / 1に、Siによって賄われていましたnergiaスイス国立科学財団助成金番号CRSII3-154405、財団ロマンドはラRECHERCHEシュールDiabète、ボーHjelt財団、財団エルンストらルーシーシュミットハイニー、およびソシエテAcadémiqueドゥジュネーブ(CDを)注ぎます。

Materials

Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesium Invitrogen 14190-094
HAM F-10 Invitrogen 41550-021 For myoblasts culture
FBS Invitrogen 10270 Supplement to culture medium
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781-100 Supplement to culture medium
Gentamycin Axon  A1492.0001 Supplement to culture medium
Fungizone Invitrogen 15290-026 Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax  Invitrogen 21885-025 For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax Invitrogen 11880-028 Recording medium for LumiCycle
Glutamax Invitrogen 35050-028 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRL Gibco 21530-027 Culture medium for islet cells
Sodium Pyruvate Gibco 11360-039 Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube Falcon 352096
F75 flask BD Falcon 353136
3.5 cm Petri dish  BD Falcon 353001
Foskolin Sigma F6886 Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
Luciferin Prolume LTD 260150 Supplement to recording medium
OptiMEM  Invitrogen 51985-026 Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagent Invitrogen 13778-150 Transfection reagent
HiPerFect reagent Qiagen 301705 Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool  Dharmacon L-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) Dharmacon D-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit  Qiagen 69504 For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit  Qiagen 74104 For myotubes RNA extraction
QIAshredder  Qiagen 79654 For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubes Axygen 311-10-051 To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 Well BD Falcon  353046 To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit  Qiagen 74034 For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit  eBioscience 88-7066-22
Human Insulin Kit Mercodia Mercodia 10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a. Acros organics 124630010 Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O)
Ethanol (>99.8%) Fluka Analytical 02860-1L Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O)
Human Islets for Research Prodo Laboratories
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R
Water bath VWR 1112A  at 37 °C
Tissu culture hood Faster  SafeFastElite
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i 5% CO2 at 37 °C
Shaker Heidolph Instruments Unimax 1010 For agitation of the siRNA mix
LumiCycle Actimetrics
LumiCycle software Actimetrics
CosinorJ software EPFL Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX  ERC GmbH Control software that controls the timing of the automated switch

References

  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).

Play Video

Cite This Article
Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (117), e54673, doi:10.3791/54673 (2016).

View Video