여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.
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방법 논문
인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정
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이 논문에서
요약
초록
일 주기성 시계는 일일 환경 변화를 예측하여 외부 세계에 적응을 허용, 모든 빛에 민감한 생물에서 기능입니다. 주기성 시계와 생리학의 대부분의 측면 사이의 긴밀한 연결에 대한 우리의 이해에 상당한 진전이 지난 10 년 동안 현장에서했다. 그러나, 인간의 주기성 발진기의 기능의 기초가되는 분자 기초를 푸는 것은 가장 높은 기술적 인 문제로 남아 있습니다. 여기서는 차 배양 된 세포에서 장기간 (2-5일) 생물 발광 기록 유출 매체 수집 실험 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이를 위해, 우리는 호르몬 분비 주기성 생물 발광들의 병렬 평가를 허용하는 코어 클록 유전자 프로모터의 제어하에있는 루시페라아제 리포터 렌티 일차 세포를 형질 도입 하였다. 더욱이, 우리는 홍보 주기성 시계를 방해하는 조건을 기술siRNA를 대상으로 시계를 형질 감염에 의해 imary 인간 세포. 인간의 췌장에 의한 인슐린 분비의 일주기 조절에 대한 연구 결과, 인간의 골격 근육 세포에 의해 myokine 분비,이 방법론의 응용 프로그램을 설명하기 위해 여기에 제시되어있다. 이러한 설정은 인간 말초 시계 분자 메이크업 공부 또는 병태 생리 학적 조건 하에서 일차 세포에 미치는 기능적 영향을 분석하기 위해 사용될 수있다.
서론
(라틴어 "년경 디엠"에서) 주기성 타이밍 시스템은 지구의 회전에 적응 메커니즘으로, 모든 빛에 민감한 생물에 등장했다. 포유 동물에서, 복부 시상 하부의 시교 차 상핵에 위치해 중앙 시계를 포괄, 계층 적 방식으로 조직하고, 주변 (또는 슬레이브) 다른 기관에서 동작한다 발진기. 또한, 이러한 세포 자율적 인 자기 유지 발진기는 본체 (1)의 거의 모든 세포의 기능입니다. SCN에서 나오는 신경과 체액 신호가 주변 시계를 재설정 반면 빛의 신호는 SCN 신경 세포에 대한 지배적 인 동기 큐 (Zeitgeber)를 나타냅니다. 차례 먹이-금식 사이클에서 운전 외에 나머지 활동 리듬에서, 주변 시계 2에 대한 더 싱크로 나이저입니다. 현재의 이해에 따르면, 코어 클록의 분자량 화장 전사 및 transla에 기초생물 사이에 보존된다적인 피드백 루프. 이 함께 음의 코어 클럭 PER과 CRY 유전자의 전사를 활성화 전사 활성화 BMAL1 및 CLOCK을 포함한다. PER 및 CRY 단백질의 높은 수준은 BMAL1 / CLOCK 복합체의 억제를 통해 자신의 전사를 억제한다. 보조 루프는 또한 BMAL1 및 CLOCK의 전사를 조절하는 핵 수용체 REV-ERBS 및....
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프로토콜
윤리 문 :이 프로토콜에 포함 노는 제네바 대학 병원의 윤리위원회와 윤리위원회 SUD EST IV (계약 1백11분의 12) (19)에 의해 승인되었다. 상용 소스에서 참조 (16, 18) 우리 설명, 또는 얻어진 인간의 섬은 제네바 대학 병원 (스위스)의 작은 섬 이식 센터에서 뇌사 멀티 장기 기증자의 췌장에서 분리 하였다.
차 세포 배양 1. 준비
- 인간의 췌장 아일릿 격리, 해리와 문화
주 : 코트 코 노트 의학 연구소 (CMRL) 셀 재료의 상당한 손실을 초래할 수있는 플라스틱 표면에 부착되는 섬 또는 섬 세포를 방지하기 위해 매체마다 튜브 플라스틱 피펫 팁 또는.- 세포 분리가 라미닌 -5 풍부한 세포 외 기질 1 ㎖를 추가 섬에 어느 날 이전에 (descri으로 804G 세포에서 파생 된3.5 cm 접시 당 기준 29)에 침대. 세포를 도금하기 전에 매트릭스를 대기음 및 살균 이중 증류수와 함께 접시에 3 번 씻는다. 접시가 5 분 동안 층류 캐비닛에서 건조하도록 허용합니다.
- 층류 캐비닛 내부, 15ml의 튜브 (들)에 CMRL 배지 얻어지는 아일렛 배포. 5 분 동안 272 XG에 원심 분리기. <....
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결과
Perifused 인간의 작은 섬 세포에서 병렬 일주기 생물 발광 녹화와 작은 섬 호르몬 분비의 평가
일 주기성 시계의 제 분자 특성화를 제공 한 후, 인간의 아일렛 셀 (16) 동작, 우리는 췌장 기능과 전사 18 클럭 방해의 영향을 연구 목적. 주기성 생물 발광 프로파일 링 (18)에 의해 측정 우리는 효율적인 siClock 형질 전환 CLOCK의 mRNA의 80 % 이상 최저의 결과 분산 된 인간의 섬 세포에서 프로토콜 (자세한 내용은 프로토콜 참조), 효율적인 클럭 제거에를 설정합니다. 포도당 유도 인슐린 분비 (GSIS) 분석은 상당히 감소 기저 및 클록 중단시 인슐린 분비를 자극 계시 (도시하지 않음). , 연중 무휴 인간의 섬 .......
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토론
여기에 설명 된 실험 설정은 다음 체외 동기화 및 며칠 동안 생물 발광의 연속 기록, 같은 세포에 의한 호르몬 분비의 병렬 분석 한 다음, 배양 된 인간의 기본 세포로의 circadian 생물 발광 기자의 렌티 바이러스 전달로 구성된다. 그들은 분자 메커니즘과 인간의 일차 전지에 주기성 시계의 기능적인 측면을 탐구하기위한 효율적인 접근 방식을 나타냅니다.
도너 재료의 품질이 가능한 기본 조직 배양의 제조를위한 중요한 과제이다. 인간의 아일렛의 품질 실험을 시작하기 전에 각각의 시간을 평가하여야한다. 추정 순도 및 / 또는 70 %보다 열등 생존과 섬이 실험을하지 않는 것이 좋습니다. 아일렛 세포 생존 및 기능에 중요한 역할을 해리 문화의 접촉을 재 구축하는 경향이있다. 췌도 세포 증식 CU 없으므로lture, 그들은 세포는 이웃 세포와 연락처를 확립 할 수있는 높은 밀도에 도금해야합니다. 이는 소량의 물방울 세포를 도금함으로써 달성된다. 중요한 세포 죽음은 저.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 제네바 대학에서 우리의 동료에게 감사 : 자크 필립이 작품에 대한 건설적인 의견, 그리고 Ueli Schibler perifusion 시스템의 개발 및 과학 영감을 귀중한 도움을 설계, 제조 및 시운전 생각하는 데에 대한 앙드레 Liani 관류 시스템의 perifusion 시스템 및 누수 biolumicorder 소프트웨어 개발에 도움을 LESA-기술 LTD 회사, 조지 SEVERI는 perifusion 실험에 대한 지원을 위해, 우르술라 Loizides-만 골드는 대한 비판적 렌티 바이러스 제제에 대한 원고를 읽기, 앤 - 마리 Makhlouf ; 에티엔 느 Lefai, 스테파니 Chanon 및 휴 버트 비달 (INSERM, 리옹) 인간의 기본 근육 아세포를 제조하는 단계; 인간의 독도를 제공 도메니코 보스코와 티에리 Berney (인간의 작은 섬 이식 센터, 제네바 대학 병원)에. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호에 의해 투자되었다 31003A_146475 / (1),시nergia 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호 CRSII3-154405, 파운데이션 부문로만 드 라 공들인 쉬르 Diabète, 보 Hjelt 재단, 파운데이션 부문 에른스트 외 루시 Schmidh....
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재료
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| DPBS 칼슘 없음 마그네슘 | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | 근아세포 배양용 |
| FBS | Invitrogen | 10270 | 배양 배지 보충제 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P0781-100 | 배양 배지에 대한 보충 |
| 겐타마이신 | 축삭 | A1492.0001 | 배양 배지 보충제 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, 배양 배지 |
| 보충제 DMEM 1g/L 포도당 + Na 피루베이트 + 글루타맥스 | Invitrogen | 21885-025 | myotubes 배양 |
| DMEM 1g/L 포도당 -Na 피루브산 - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 세포 분리 솔루션, 섬 세포 해리용 |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | 섬 세포용 배양 배지 |
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| 에탄올 (>99.8 %) | Fluka Analytical | 02860-1L | 용해 완충액 (375 ml 에탄올 + 7.5 % HCl + 117.5 % H2< / sub>O) |
| Prodo Laboratories | 용 인간 섬 | ||
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| Tissu 배양 인큐베이터 | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 ° C, LumiCycle 설치 |
| Tissu 배양 인큐베이터 | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °로 인해 물이 없습니다. C, LumiCycle 설치 |
| Tissu 배양 인큐베이터 | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 ° C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | siRNA 혼합물의 교반을 위해 |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle 소프트웨어 | Actimetrics | ||
| CosinorJ 소프트웨어 | EPFL | 자유롭게 사용 가능: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | 자동 스위치의 타이밍을 제어하는 제어 소프트웨어 |
참고문헌
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of cent....
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재인쇄 및 허가
