Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Dygnsklockan är funktionella i alla ljuskänsliga organismer, vilket möjliggör en anpassning till den yttre världen genom att förutse dagliga miljöförändringar. Betydande framsteg i vår förståelse av den täta förbindelsen mellan dygnsrytm klocka och de flesta aspekterna av fysiologi har gjorts på området under det senaste decenniet. Emellertid unraveling den molekylära grunden som ligger bakom funktionen av den cirkadiska oscillatorn hos människor stannar av högsta teknisk utmaning. Här ger vi en detaljerad beskrivning av en experimentell metod för långsiktig (2-5 dagar) mareld inspelning och utflöde medel samling i odlade humana primära celler. För detta ändamål har vi transducerade primära celler med en lentiviral luciferas reporter som är under kontroll av en klockfrekvens genpromotor, som möjliggör för den parallella bedömning av hormonutsöndring och dygnsrytm bioluminescens. Dessutom beskriver vi förutsättningarna för att störa dygnsrytm klocka i primary humana celler genom transfektion siRNA inriktning klocka. Våra resultat på den cirkadiska regleringen av insulinsekretion av humana pankreasöar, och myokine utsöndring av humana skelettmuskelceller, presenteras här för att illustrera tillämpningen av denna metod. Dessa inställningar kan användas för att studera den molekylära makeup av humana perifera klockor och analysera deras funktionella effekter på primära celler under fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd.
Introduction
Dygnsrytm tidtagningssystem (från latin "Circa diem") har framkommit i alla ljuskänsliga organismer, som en adaptiv mekanism till jordens rotation. I däggdjur, är det organiserat i ett hierarkiskt sätt, som omfattar den centrala klockan, som är belägen i suprachiasmatiska kärnan av den ventrala hypotalamus, och perifer (eller slav) oscillatorer som är operativa i olika organ. Dessutom är dessa cell autonoma självunderhållande oscillatorer är funktionella i nästan varje cell i kroppen 1. Fotiska signaler utgör en dominerande synkroniserings cue (Zeitgeber) för SCN nervceller, medan neurala och humorala signalerna från SCN återställa perifera klockor. I tillägg vila aktivitetsrytmer, som driver i sin tur inmatnings fasta cykler, är ytterligare synkroniserings för perifera klockor 2. Enligt vår nuvarande kunskap, är den molekylära makeup av klockfrekvens baserat på transkriptionell och översätttionella återkopplingsslingor, vilka är konserverade mellan organismer. Detta omfattar transkriptionsaktivatorer BMAL1 och klocka, som tillsammans aktiverar transkription av de negativa klockfrekvens PER och gråta gener. Höga nivåer av PER och Cry-proteiner kommer att hämma sin egen transkription genom hämning av BMAL1 / CLOCK-komplexet. En extra slinga består av nukleära receptorer REV-Erbs och speglarna, som också reglerar transkriptionen av BMAL1 och klocka. Dessutom posttranslationella händelser, inklusive fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, nedbrytning och nukleära inträde av klockfrekvens proteiner representerar en ytterligare viktig reglerande skikt i upprättandet 24 hr svängningscykel 3.
Ackumulerande bevis kommer från studier i gnagarmodeller och belyser den avgörande betydelsen av dygnsrytm systemet i samordningen av metabola och endokrina funktioner 4-5. Ett antal large-skala transkriptom analys tyder på att utfodring – fasta cykler spelar en central roll i synkroniseringen av perifera oscillatorer 6-8. I ett avtal med dessa studier har metabolomic och lipidomic analys hos gnagare och människor visade att ett stort antal metaboliter svänga i vävnad, plasma och saliv på en dygnsrytm sätt 9-11. Viktigt är de flesta hormoner uppvisar dygnsrytmen i blodet 5,12-13. Dessutom kan dygns klockor motsvarande hormonproducerande perifer vävnad reglera hormonutsöndring lokalt. Cell autonom dygnsrytm oscillatorer har beskrivits i gnagare och humana bukspottcellöar 14-16. Dessa oscillatorer spelar en viktig roll i regleringen av pankreasö transkriptom och funktion 15,17-18. Dessutom har myokine utsöndring av mänskliga skelett myotuber nyligen visat sig uppvisa en dygnsrytm mönster, som regleras genom cellautonoma oscillators operativa i dessa celler 19.
Flera tillvägagångssätt för att studera dygnsrytmen i människor in vivo har använts i stor utsträckning. Till exempel, har plasma melatonin eller kortisolnivåer samt bröst hud yttemperatur (granskas i referenserna 3,20) studerats för att bedöma endogena dygnsklockan. Även om dessa metoder tillåter att studera system dygnsrytm svängningar in vivo, de är långt från att ge en tillförlitlig bedömning av fritt rinnande autonoma dygnsrytm i olika organ och vävnader. Ändå skulle en sådan dissektion från den systemiska regleringen vara ett oumbärligt verktyg för att förstå den specifika effekten av intracellulära molekylär klocka på funktionen av dessa celler. Därför har stora ansträngningar gjorts för att utveckla tillförlitliga metoder för att studera mänskliga klockor i immortaliserade eller primära odlade celler synkroniserade in vitro. Viktigare, har det visats attklocka egenskaper mätt i odlade primära hudfibroblastceller noggrant återspegla de enskilda klock egenskaperna hos hela organismen 21. Utvecklingen av fluorescerande och självlysande dygnsrytm reportrar har i hög grad avancerade detta tillvägagångssätt 22-27. Dessutom studerar primära cell klockor som härrör från olika perifera organ gör det möjligt att undersöka de molekylära egenskaperna hos humana vävnadsspecifika klockor 3,5,16,19-20,28. Således, bedömning av dygns klockor i in vitro synkroniserade primära explantat eller celler genom att använda självlysande reportrar, utgör en mycket användbar metod för att studera den molekylära makeup av humana perifera klockor och deras inverkan på organfunktion.
I denna artikel kommer vi att presentera detaljerade protokoll för att bedöma dygns genuttryck i humana primära ö och skelettmuskelceller synkroniserade in vitro liksom effekterna av autonoma cellulära klockastörningar på den sekretoriska funktionen hos dessa celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentella inställningar som beskrivs här består av Lentiviral leverans av dygns mareld reportrar i odlade humana primära celler, följt av efterföljande in vitro synkronisering och kontinuerlig registrering av bioluminiscens i flera dagar, och parallell analys av hormonutsöndring av samma celler. De representerar en effektiv strategi för att utforska molekylära mekanismer och funktionella aspekter av dygnsklockan i humana primära celler.
Kvaliteten på donatormateri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för våra kollegor från University of Geneva: Jacques Philippe för konstruktiva synpunkter på detta arbete, Ueli Schibler för ovärderlig hjälp med utvecklingen av perifusion systemet och för vetenskaplig inspiration, André Liani för att ha tänkt konstruktion, tillverkning och driftsättning av perfusionssystemet, Lesa-Technology Ltd bolag för stöd i perifusion systemet och Dropps biolumicorder mjukvaruutveckling, George Severi för hjälp med perifusion experiment Ursula Loizides-Mangold för kritiskt läsa manuskriptet, och Anne-Marie Makhlouf för lentivirus preparat ; till Etienne Lefai, Stéphanie Chanon och Hubert Vidal (INSERM, Lyon) för framställning av humana primära myoblaster; och Domenico Bosco och Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Geneva Universitetssjukhuset) för att ge humana öar. Detta arbete har finansierats av Swiss National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, och Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
