Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
En las últimas décadas, las tecnologías de imágenes han revolucionado la forma en que los médicos a diagnosticar y controlar la enfermedad. Estas tecnologías de la imagen, sin embargo, han sido en gran parte limitada a los sistemas de formación de imágenes de todo el cuerpo, como la tomografía por emisión de positrones (PET), emisión de fotón único tomografía computarizada (SPECT), tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN). Especial atención se ha prestado a cáncer, y los avances tecnológicos de imagen han mejorado en gran medida la forma en que esta enfermedad es diagnosticada y tratada. A pesar de estos avances, hay un lugar donde estas tecnologías de imagen simplemente no encajan: la sala de operaciones. Mientras que las técnicas de imagen de todo el cuerpo puede ayudar en la planificación quirúrgica, por lo general carecen de resolución espacial lo suficientemente altas como para ayudar a los médicos a determinar en tiempo real si todo el tejido del tumor ha sido eliminado o tejido tumoral residual permanece oculto en los márgenes quirúrgicos 1. Asegurándose de que no infiltrantelos márgenes del tumor se quedan atrás es uno de los objetivos quirúrgicos más importantes, y los cirujanos deben caminar una cuerda floja entre la resección de tejido rigurosa y prudente. Si se quita demasiado, se exacerban los efectos secundarios no deseados para el paciente; si no hubiese suficiente se retira, las tasas de recurrencia se incrementan 2, 3. Por lo tanto, es crucial para delinear los márgenes tumorales precisos, y creemos que las imágenes intraoperatorias quimioluminiscente puede ayudar a mejorar la precisión de la identificación de los márgenes del tumor, ayudando a los cirujanos visualizar el tejido maligno que de otro modo podrían no ser detectados con técnicas establecidas.
Hay muchas tecnologías de imagen que actualmente se investigan por su posible utilidad como sistemas de imágenes intraoperatorias. Estos incluyen sondas y ß-γ-emisores de radiación de fluorescencia óptica 4, 5, 6 espectroscopia Raman </sup>, 7 y Cherenkov luminiscencia 8, 9. Hasta la fecha, sin embargo, ninguno de ellos se han establecido como herramientas clínicas estándar. imágenes de fluorescencia óptica hasta ahora ha demostrado ser el más prometedor de estas técnicas y por lo tanto es el más explorado. Si bien ya se ha demostrado ser una herramienta valiosa para muchas aplicaciones, no es sin sus limitaciones. De hecho, su principal inconveniente es la fluorescencia de fondo generado por el tejido biológico inherentemente autofluorescent. Esta señal de fondo autofluorescente es un producto de la excitación del tejido circundante, además de la fluoróforo, por la fuente de luz externa necesaria para la generación de una señal fluorescente. Desde una perspectiva práctica, esta autofluorescencia puede potencialmente conducir a bajas relaciones señal-ruido, que pueden limitar la utilidad de esta tecnología en la sala de operaciones.
El directorventaja de quimioluminiscencia de imágenes sobre imágenes de fluorescencia es que ninguna luz de excitación es necesario. Como resultado, no hay fondo autofluorescencia. En las imágenes de quimioluminiscencia, la energía de excitación en su lugar se genera químicamente. Este proceso no produce señal de fondo no deseada y por lo tanto puede dar lugar a mayores relaciones de señal a ruido. Esto podría resultar en última instancia, la detección más precisa y exacta de los márgenes quirúrgicos. Sorprendentemente, la utilidad de este enfoque como una técnica de imagen intraoperatoria ha permanecido inexplorado 10. De hecho, el ejemplo más cercano a esta técnica es la oxidación del luminol por la mieloperoxidasa en ratones 11, 12, 13. Por lo tanto, las imágenes biomédicas quimioluminiscente es una zona bastante inexplorada de la investigación que podría ofrecer las siguientes ventajas: (1) autofluorescencia mínima que resulta en una señal de fondo baja con hiGher relaciones de señal a ruido; (2) longitudes de onda sintonizables de las emisiones de quimioluminiscencia que van desde lo visible a lo infrarrojo cercano; y (3) los complejos de quimioluminiscencia funcionalizables que, cuando se combina con las tecnologías de engarce y biomoléculas que ya existen dirigido, proporcionan acceso a bibliotecas enteras de sondas de imagen moleculares específicos 14.
Este estudio de prueba de principio ilustra la utilidad potencial de las imágenes quimioluminiscente en el entorno biomédico utilizando un agente de formación de imágenes basado en rutenio. Las propiedades de este compuesto quimioluminiscente están bien estudiados, con las investigaciones que se remontan a mediados de la década de 1960 15. Tras la activación química, el agente produce la luz en torno a 600 nm 16, que es muy adecuado para los propósitos de imágenes médicas. La energía de activación se proporciona por una reacción redox que conduce a un estado excitado, que tiene una duración de 650 ns en agua 17 -folladeudado por la generación de fotones sobre la relajación de este estado excitado. A través del uso de un nebulizador a distancia especialmente diseñado, hemos sido capaces de detectar el compuesto tanto ex vivo como in vivo. Los resultados de los experimentos iniciales son muy prometedores, lo que sugiere una mayor investigación de esta tecnología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos presentado una tecnología que es capaz de delinear ópticamente tejido por medio de la emisión de fotones creados por un reportero de quimioluminiscencia. En contraste con otras, más establecido, las tecnologías de 4, 5, 6, 7, 8, 9, este sistema reportero quimioluminiscente emplea una sonda de formación de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
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