जी प्रोटीन चयनात्मक GPCR रचना एक जीवित कोशिका सस्पेंशन fluorometer परख में झल्लाहट सेंसर का उपयोग करके मापा
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित अध्ययनों GPCR संकेतन की जांच में तेजी से सामान्य हो गए हैं। हमारे शोध समूह Gα सब यूनिटों और एगोनिस्ट उत्तेजना के बाद जीवित कोशिकाओं में GPCRs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए एक अंतर-आणविक झल्लाहट सेंसर विकसित किया है। यहाँ, हम विस्तार परिवर्तन 100 माइक्रोन के isoproterenol हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज पर β 2 -adrenergic रिसेप्टर और Gαs सी टर्मिनस के बीच पेप्टाइड झल्लाहट में पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल पहले से 1 की विशेषता के रूप में। हमारे झल्लाहट सेंसर एक एकल एक पूरी लंबाई की GPCR, एक झल्लाहट स्वीकर्ता fluorophore (mCitrine) के क्रमानुसार मिलकर पॉलीपेप्टाइड है, एक ईआर / कश्मीर ऐंठन (व्यवस्थित प्रोटीन आकर्षण शक्ति मॉडुलन) लिंकर, एक झल्लाहट दाता fluorophore (mCerulean), और एक Gα सी -terminal पेप्टाइड। इस प्रोटोकॉल विस्तार होगा सेल तैयारी, अभिकर्मक शर्तों, उपकरण सेटअप, परख निष्पादन, और डेटा विश्लेषण। इस प्रयोगात्मक डिजाइन छोटे CH का पता लगाता हैAnges झल्लाहट में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का संकेत है, और भी ligands और GPCR-जी प्रोटीन pairings भर में बातचीत की ताकत की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संकेत करने वाली शोर हमारे माप में वृद्धि करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सभी चरणों में बढ़ परिशुद्धता की आवश्यकता है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्पादन सक्षम करने के लिए यहां प्रस्तुत किया है।
Introduction
जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) सात transmembrane रिसेप्टर्स हैं। अकेले मानव जीनोम लगभग 800 GPCRs, जो प्रकाश, odorants, हार्मोन, पेप्टाइड्स, दवाओं और अन्य छोटे अणुओं सहित ligands की एक किस्म से सक्रिय कर रहे हैं के लिए कोडिंग जीन होता है। बाजार लक्ष्य GPCRs पर वर्तमान में सभी दवाइयों का लगभग 30% है क्योंकि वे कई रोग राज्यों 2 में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं। व्यापक काम इस रिसेप्टर परिवार पर किया दशकों के बावजूद, वहाँ विशेष रूप से आणविक तंत्र है कि ड्राइव GPCR-प्रेरक बातचीत के संबंध के साथ क्षेत्र में महत्वपूर्ण बकाया सवाल बने हुए हैं। तिथि करने के लिए, केवल एक उच्च संकल्प क्रिस्टल संरचना प्रकाशित किया गया है, β 2 -adrenergic रिसेप्टर (β 2 -ar) और जी एस प्रोटीन 3 के बीच बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। साथ में पिछले तीन दशकों में व्यापक अनुसंधान के साथ, यह एक विशिष्ट संरचनात्मक घटक है कि इस में महत्वपूर्ण है दोहरातीबातचीत: Gα सबयूनिट सी टर्मिनस। इस संरचना GPCR 4 और जी प्रोटीन चयन 5-6 से दोनों जी प्रोटीन सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, Gα सी टर्मिनस GPCR के ligand उत्तेजना और चयनात्मक जी प्रोटीन सक्रियण के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान करता है।
पिछले एक दशक में अनुसंधान से पता चलता है कि GPCRs GPCR रचना के सबसेट स्थिर ligand बाध्यकारी के साथ एक व्यापक परिदृश्य गठनात्मक आबाद। जबकि क्रि, एनएमआर और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित कई तकनीकों, GPCR गठनात्मक परिदृश्य की जांच करने के लिए उपलब्ध हैं, वहाँ दृष्टिकोण की एक कमी प्रेरक चयन 7 में उनके कार्यात्मक महत्व को स्पष्ट करने के लिए है। यहाँ, हम जी प्रोटीन चयनात्मक GPCR रचना पता लगाने के लिए एक Fӧrster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित दृष्टिकोण की रूपरेखा। झल्लाहट ओवरलैपिंग उत्सर्जन (दाता) एक साथ निकटता और दो fluorophores के समानांतर रुख पर निर्भर करता हैएन डी उत्तेजना (स्वीकर्ता) स्पेक्ट्रा 8। के रूप में दाता और स्वीकर्ता fluorophores करीब एक साथ आने के प्रोटीन में या तो गठनात्मक परिवर्तन या एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक परिणाम के रूप में, उन दोनों के बीच झल्लाहट बढ़ जाती है, और तरीकों 8 की एक सीमा का उपयोग करके मापा जा सकता है। झल्लाहट आधारित biosensors GPCR क्षेत्र 9 में बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। वे तीसरे intracellular पाश और GPCR सी टर्मिनस में दाता और स्वीकर्ता डालने से GPCR में रचना परिवर्तन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है; सेंसर अलग से एक झल्लाहट जोड़ी 10 के साथ GPCR और प्रेरक (जी प्रोटीन सब यूनिटों / arrestins) लेबल करके GPCR और प्रेरक बातचीत की जांच के लिए डिजाइन किया गया है; कुछ सेंसर भी जी प्रोटीन 11 में गठनात्मक परिवर्तन का पता लगाने। ये biosensors क्षेत्र सक्षम है GPCR में गठनात्मक परिवर्तन और प्रेरक, प्रेरक GPCR-बातचीत के कैनेटीक्स, और allosteric ligands के 12 सहित बकाया सवालों की एक भीड़ पूछने के लिए। हमारा समूहविशेष रूप से एक biosensor कि एगोनिस्ट संचालित की शर्तों के तहत जी प्रोटीन विशिष्ट GPCR रचना पता लगा सकता है बनाने में दिलचस्पी थी। इस biosensor ऐंठन (व्यवस्थित प्रोटीन आकर्षण शक्ति मॉडुलन) 13 नाम के एक हाल ही में विकसित तकनीक पर निर्भर करता है। ऐंठन टेदरिंग बातचीत एक ईआर / कश्मीर लिंकर, जो उनके प्रभावी नियंत्रण का उपयोग कर सांद्रता प्रोटीन डोमेन शामिल है। Fluorophores की एक जोड़ी के साथ झल्लाहट लिंकर flanking एक उपकरण है जो प्रोटीन 12 के बीच बातचीत की स्थिति की रिपोर्ट कर सकते हैं बनाता है। इससे पहले 1 ऐंठन मॉड्यूल एक GPCR को Gα सी टर्मिनस तार और झल्लाहट fluorophores के साथ उनकी बातचीत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था, mCitrine (करने के लिए इस प्रोटोकॉल में अपनी सामान्यतः ज्ञात संस्करण, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), उत्तेजना / उत्सर्जन में चोटी द्वारा भेजा 490/525 एनएम) और mCerulean, उत्तेजना / उत्सर्जन चोटी 430/475 एनएम) (अपने सामान्यतः ज्ञात संस्करण सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी द्वारा इस प्रोटोकॉल में कहा गया है)। एन से सी टर्मिनस के लिए, टीउसकी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एकल पॉलीपेप्टाइड शामिल हैं: एक पूरी लंबाई की GPCR, स्वीकर्ता (mCitrine / YFP) झल्लाहट, 10 एनएम ईआर / कश्मीर लिंकर, झल्लाहट दाता (mCerulean / सीएफपी), और Gα सी टर्मिनस पेप्टाइड। इस अध्ययन में, सेंसर GPCR-लिंकर लंबाई-Gα पेप्टाइड के रूप में संक्षिप्त कर रहे हैं। सभी घटकों एक असंरचित (Gly-SER-Gly) 4 लिंकर जो प्रत्येक डोमेन से मुक्त रोटेशन सक्षम बनाता से अलग होती है। इस तरह के सेंसर का विस्तृत लक्षण वर्णन पहले दो प्रोटोटाइप GPCRs उपयोग किया गया था: 2 -ar और opsin 1 β।
यह सेंसर क्षणिक HEK-293T कोशिकाओं और fluorometer आधारित जीवित कोशिका के प्रयोगों उपस्थिति या ligand के अभाव में प्रति सेकंड (सीपीएस) की गिनती के मनमाना इकाइयों में झल्लाहट जोड़ी के उपाय प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में ट्रांसफ़ेक्ट है। इन मापों fluorophores (YFP अधिकतम / सीएफपी मैक्स) के बीच एक झल्लाहट अनुपात की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। झल्लाहट (ΔFRET) में बदलाव तो औसत झल्लाहट अनुपात घटाकर की जाती हैligand इलाज के नमूने की झल्लाहट अनुपात से की इलाज के नमूने। ΔFRET (β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड 2 -ar-10 एनएम कोई पेप्टाइड बीटा बनाम) निर्माणों भर में तुलना की जा सकती। यहाँ, हम विस्तार प्रोटोकॉल लाइव HEK-293T कोशिकाओं में इन सेंसरों व्यक्त करने के लिए, उनकी अभिव्यक्ति की निगरानी, और सेटअप, निष्पादन, और fluorometer आधारित जीवित कोशिका का विश्लेषण बनाम दवा इलाज किया शर्तों इलाज के लिए माप झल्लाहट। हालांकि इस प्रोटोकॉल β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड सेंसर 100 माइक्रोन के isoproterenol bitartrate के साथ इलाज के लिए विशिष्ट है, यह अलग-GPCR Gα जोड़े और ligands के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रणाली में झल्लाहट माप की तंग गतिशील रेंज इस प्रोटोकॉल के हर कदम में संवेदनशील गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता पुष्ट। एक सफल झल्लाहट प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम 1) सेल संवर्धन, 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
रम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (14PRE18560010) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अनुसंधान अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14270009) और एनआईएच (1DP2 CA186752-01 और 1-R01 जीएम- 105646-01-A1) एस एस द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
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