Summary

Generieren<em> De Novo</em> Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR & agr; oder TCR & bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Abstract

T-Zell-Rezeptoren (TCR) verwendet klinisch die Spezifität von T-Zellen zu lenken Tumoren als eine viel versprechende Modalität der Immuntherapie zu zielen. Daher ist die Klonierung TCRs spezifisch für verschiedene Tumor-assoziierte Antigene war das Ziel vieler Studien. eine wirksame T-Zell-Antwort hervorzurufen, muss das TCR das Zielantigen mit optimaler Affinität erkennen. Es wurde jedoch Klonierung solche TCRs eine Herausforderung und viele verfügbare TCRs besitzen suboptimalen Affinität für das zugehöriges Antigen. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum Klonieren von de novo hoher Affinität antigen-spezifischen TCRs vorhandene TCRs durch hemichain centricity ausnutzt. Es ist bekannt, dass für einige TCRs jedes TCR & agr; oder TCR & bgr; hemichain nicht in gleicher Weise für die Antigenerkennung beitragen, und die dominante hemichain als zentrische hemichain bezeichnet. Wir haben, dass von der ursprünglichen Gegenkette unterscheiden durch Paarung der centric hemichain mit Gegen Ketten gezeigt, wir sind in der Lage, das Antigen s zu haltenpecificity, während die Wechselwirkungsstärke für das zugehöriges Antigen zu modulieren. Somit kann das therapeutische Potential einer gegebenen TCR durch Optimierung der Kopplung zwischen den zentrisch und Zähler hemichains verbessert werden.

Introduction

T-Zell-Rezeptoren (TCRs) sind heterodimere adaptive Immunrezeptoren von T-Lymphozyten exprimiert wird, die aus einer TCR & agr; und TCR & bgr; Kette. Sie werden über somatische Umordnung von V (D) J-Gensegmenten erzeugt, die praktisch unbegrenzte Konfigurationen von HLA / Peptid-Komplexe eine sehr vielfältige Repertoires der Lage zu erkennen, erzeugt. Klinisch entwickelt T – Zellen klonotypischen TCRs spezifisch für tumorassoziierte Antigene zu exprimieren zeigten Wirksamkeit bei einer Vielzahl von Krebsarten 1. Allerdings fehlt für das Antigen von Interesse ausreichende Affinität viele TZR für diesen Zweck geklont, die ihre therapeutische Anwendung begrenzen.

Hier beschreiben wir eine Methode, um diese Einschränkung für bestehende TZR zu überwinden, indem Kette Zentriert nutzen. Es wurde berichtet, dass ein TCR hemichain 2 eine dominantere Rolle bei der Erkennung des Zielantigens spielen könnte, hier genannt centricity. Kristallstrukturanalysen haben gezeigt, dass eine zentrierte gezeigthemichain eines TCR könnte für die Mehrheit des Fußabdrucks Konto auf dem MHC / Peptid – Komplex 3,4. Mit diesem Konzept haben wir bereits gezeigt , dass die SIG35α TCR & agr; mit einem vielfältigen Repertoire von TCR & bgr; Ketten paaren und zu pflegen Reaktivität gegen das MART1 27-35 Peptid präsentiert von HLA-A2 5. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem TAK1 TCR erhalten, wobei die zentrische TCR & bgr; hemichain mit verschiedenen TCR & agr; Ketten gekoppelt und gehalten Reaktivität für das WT1 235-243 Peptid durch HLA-A24 präsentiert 6. Sowohl MART1 und WT1 sind tumorassoziierte Antigene. Kettenzentriertheit wurde auch 7 durch Paarung die invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCR & agr; Kette von menschlichem iNKT TZR mit verschiedenen Vβ11 TCR & bgr; Ketten zu studieren Antigenerkennung von CD1d beschränkten invariant natürliche Killerzellen (iNKT) TZR, angewendet.

In allen Fällen konnten wir eine Denovo – Repertoire von TZR durch trans zu erzeugenGabe die zentrierte TCR hemichain zu peripheren T-Zellen Blut, wo die eingeführte hemichain mit dem endogenen TCR & agr; oder TCR & bgr; Gegenketten gepaart. Im Wesentlichen dient die zentrische hemichain als Köder, die verwendet werden können, die entsprechenden Gegen Ketten zu identifizieren, die, wenn sie miteinander gepaart TCRs bilden, die die Antigenspezifität von Interesse aufrechtzuerhalten, noch in Affinitäts variiert. Von diesen neuen Repertoires konnten wir klonotypischen TZR mit verbesserter Wechselwirkungsstärke gegen das Zielantigen zu isolieren, im Vergleich zu bereits bestehenden TZR. Deshalb glauben wir, diese Methode wird die Pipeline zu identifizieren optimale TZR für die klinische Anwendung zu beschleunigen.

Protocol

1. Vorbereiten Retrovirale Encoding TCR Hemichain of Interest Construct Linearisieren pMX Vektor, der das Einführen eines TCR-Gens in anschließenden Schritten zu ermöglichen. Digest die Plasmid – DNA mit EcoRI und NotI – Restriktionsenzymen bei 37 ° C für 3 Stunden (Tabelle 1) 8. Führen Sie die Elektrophorese der verdauten Plasmid auf 1,2% Agarose-Gel. Excise Bande von etwa 4500 Basenpaaren (bp) und elute in 30 ul sterilem Wasser mit handelsüblichen -Gelextraktions…

Representative Results

Ohne vorherige Kenntnis davon hemichain ist Kette zentrierten sollte die TCR & agr; und TCR & bgr; Kette getrennt kloniert und auf peripheren Blut – T – Zellen transduziert werden, die im Fall von HLA-A24 / WT1 reaktiven TAK1 TCR (Bild 1) durchgeführt wurde. Transduktion von TAK1β ergab eine deutlich höhere Frequenz von Antigen-spezifischen T-Zellen. Im Gegensatz dazu , Transduktion eines nicht-zentrierten hemichain würde de novo Multimer positiven T…

Discussion

Die erste Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ist das Erreichen ausreichender Transduktionseffizienz von primären T-Zellen mit dem hemichain von Interesse. Nach unserer Erfahrung ist die Kombination der Verwendung von PG13 als Verpackungszelllinie und pMX als retroviraler Vektor Ergebnisse in stabile und effiziente Expression des eingeführten Gens in humanen primären T-Zellen. PG13 Verpackungszellen können Einzelzelle für hochtitrige Verpackungszellen auszuwählen geklont sein Transdukt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

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Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

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