Generazione<em> De Novo</em> Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain
Summary
Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.
Abstract
recettori delle cellule T (TCR) sono utilizzati clinicamente per dirigere la specificità delle cellule T a colpire i tumori come modalità promettente di immunoterapia. Pertanto, TCR clonazione specifici per diversi antigeni associati al tumore è stato l'obiettivo di molti studi. Per suscitare una risposta delle cellule T efficace, il TCR deve riconoscere l'antigene bersaglio con affinità ottimale. Tuttavia, la clonazione come TCR è stata una sfida e molti disponibili TCR possedere affinità sub-ottimale per l'antigene cognate. In questo protocollo, si descrive un metodo di clonazione de novo ad alta affinità TCR antigene-specifiche che utilizzano TCR esistenti sfruttando hemichain centralità. È noto che per alcuni TCR, ogni TCRα o TCRβ hemichain non contribuiscono ugualmente al riconoscimento dell'antigene, e il hemichain dominante è indicato come il hemichain centric. Abbiamo dimostrato che accoppiando il hemichain centrica con contro-catene differenti dal contatore-catena originale, siamo in grado di mantenere l'antigene specificity, mentre modulando la sua forza di interazione per l'antigene cognate. Pertanto, il potenziale terapeutico di un dato TCR può essere migliorata ottimizzando l'accoppiamento tra le centric e contro hemichains.
Introduction
recettori delle cellule T (TCR) sono eterodimeriche recettori immunitarie adattative espressi dai linfociti T, composto da una catena TCRα e TCRβ. Essi sono generati mediante riarrangiamento somatica di V (D) J segmenti genici, che produce un repertorio altamente diversificata capace di riconoscere configurazioni praticamente illimitata di complessi HLA / peptide. Clinicamente, cellule T ingegnerizzate per esprimere clonotypic specifico TCR per antigeni tumore-associati hanno dimostrato l'efficacia in una varietà di tumori 1. Tuttavia, molti TCR clonati per questo scopo non hanno sufficiente affinità per l'antigene di interesse, che limitano la loro applicazione terapeutica.
Qui, descriviamo un metodo per superare questo limite per TCR esistenti sfruttando catena di centralità. E 'stato riportato che un TCR hemichain potrebbe svolgere un ruolo più dominante in riconoscimento del target dell'antigene 2, qui chiamato centralità. analisi strutturali cristallo hanno dimostrato che uno centrichemichain di un TCR potrebbe spiegare la maggioranza della impronta sulla MHC / peptide complesso 3,4. Usando questo concetto, abbiamo precedentemente dimostrato che l'SIG35α TCRα può accoppiare con un repertorio vario di catene TCRβ e mantenere la reattività contro il peptide MART1 27-35 presentato da HLA-A2 5. Risultati simili sono stati ottenuti con l'TAK1 TCR, dove il centric TCRβ hemichain accoppiato con varie catene TCRα e mantenuto reattività per il peptide WT1 235-243 presentati da HLA-A24 6. Sia MART1 e WT1 sono antigeni associati al tumore. Catena-Centricity è stato applicato anche per studiare il riconoscimento dell'antigene di TCR invarianti CD1d-ristrette natural killer (iNKT), accoppiando la catena invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα di TCR iNKT umani con diverse catene Vβ11 TCRβ 7.
In tutti i casi, siamo stati in grado di generare un repertorio de novo di TCR da transdurre il centrica TCR hemichain alle cellule T del sangue periferico, dove il hemichain introdotto accoppiato con il TCRα endogena o TCRβ contro-catene. In sostanza, il hemichain centric serve come esca che può essere utilizzato per identificare le opportune contromisure catene, che quando accoppiati insieme formano TCR che mantengono la specificità antigene di interesse, ma variano in affinità. Da questi nuovi repertori, siamo stati in grado di isolare TCR clonotypic con resistenza migliorata interazione contro l'antigene bersaglio rispetto al TCR preesistenti. Pertanto, riteniamo che questo metodo accelererà la pipeline di identificare TCR ottimali per l'applicazione clinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il primo requisito per l'applicazione di successo di questo metodo sta ottenendo sufficiente efficienza di trasduzione delle cellule T primarie con il hemichain di interesse. Nella nostra esperienza, la combinazione di utilizzare PG13 come linea cellulare di packaging e PMX come risultati vettore retrovirale in espressione stabile ed efficiente del gene introdotto nelle cellule T primarie umane. cellule packaging PG13 possono essere unicellulare clonato per selezionare le celle per imballaggio alto titolo per miglio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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